DE69907630T2

DE69907630T2 - Mikropartikel mit multiplen fluoreszenz-signalen

Info

Publication number: DE69907630T2
Application number: DE69907630T
Authority: DE
Inventors: B. Mark CHANDLER; Don Chandler
Original assignee: Luminex Corp
Current assignee: Luminex Corp
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2019-01-23
Also published as: US6268222B1; HK1028423A1; EP1049807A4; WO1999037814A1; EP1049807A1; CA2318779A1; EP1049807B1; JP3468750B2; KR20010040392A; JP2002501184A; KR100593712B1; ATE239801T1; DE69907630D1; CA2318779C; WO1999037814A9; AU2464299A

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Strömungszytometrie, insbesondere Mikroteilchen, welche an ihrer berfläche polymere Nanoteilchen tragen, die mit einem oder mehreren fluoreszierenden Farbstoffen gefärbt sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fluoreszierende, polymere Teilchen fanden oftmals als Markierungsmittel und Indikatoren bei verschiedenen biomedizinischen Tests Verwendung. Die im Folgenden benutzten Begriffe Mikroteilchen, Mikropartikel, Mikrokugeln oder Mikroperlen werden gegenseitig austauschbar verwendet und besitzen gleichwertige Bedeutungen, wenn sie sich auf kleine Teilchen mit einem Gesamtdurchmesser beziehen, der im wesentlichen in den Mikrometerbereich fällt. Die Begriffe Nanokugeln, Nanoteilchen, Nanopartikel oder Nanoperlen beziehen sich auf kleinere Teilchen mit einer Gesamtgröße, die im wesentlichen in den Nanometerbereich fällt. Der im Folgenden verwendete allgemeine Begriff Teilchen, Partikel, Kugeln oder Perlen bezieht sich sowohl auf Mikroteilchen als auch Nanoteilchen, die wirksam als feste Träger oder feste Phase dienen. Fluoreszierende Teilchen werden üblicherweise durch Einbetten oder Diffundieren eines fluoreszierenden Farbstoffs gemäß dem ursprünglich von L. B. Bangs beschriebenen Verfahren (Uniform Latex Particles; Seragen Diagnostics Inc. 1984, S. 40) erhalten. Zur Färbung von Teilchen mit fluoreszierenden Farbstoffen sind auch andere Verfahren bekannt. Die im Folgenden benutzten Begriffe fluoreszierender Farbstoff, Fluoreszenzmittel, Fluorochrom oder Fluorophor werden gegenseitig austauschbar verwendet und besitzen gleichwertige Bedeutungen. Die Mikroteilchen können sodann manuelle oder durch andere bekannte Verfahren, vorzugsweise jedoch unter Verwendung eines automatisierten Verfahrens, wie zum Beispiel der Strömungszytometrie, analysiert werden, wie in US-Patent 4,665,024 von Mansour et al. offenbart ist.
Die vielseitige Verwendungsmöglichkeit dieser Teilchen kann durch Einarbeitung einer Vielzahl von Farbstoffen in ein einziges Teilchen erhöht werden, wobei jeder Farbstoff einzigartige Spektraleigenschaften besitzt. Der Fachmann erkennt, dass zwei oder mehrere Farbstoffe in verschiedenen Anteilen zur Erhöhung der Austauschanzahl von einzigartigen Farbstoffkombinationen an einem einzigen Teilchen benutzt werden können. Während sich eine einfache Absorption eines einzigen Farbstoffs in ein Teilchen für die meisten Zwecke als ausreichend erwies, treten einige Probleme auf, wenn mehr als ein Farbstoff in ein Teilchen absorbiert wird.
Zuerst führt die enge Nachbarschaft eingebetteter Farbstoffmoleküle zu einem wesentlichen Ausmaß eines Fluoreszenzenergietransfers. Dieser Energietransfer führt zu Fluoreszenzemissionen, welche nicht mit den relativen Farbstoffkonzentrationen und ihren ursprünglichen Emissionsmustern übereinstimmen.
Ein anderes Problem tritt auf, wenn die verwendeten Farbstoffsubstanzen unterschiedliche Löslichkeiten im zur Einarbeitung des Farbstoffs in die Teilchen benutzten Lösungsmittel besitzen. Da alle Farbstoffe gleichzeitig adsorbiert werden müssen, sind mögliche Farbstoffverhältnisse durch Lösungsmitteleigenschaften beschränkt.
Ein drittes Problem, das angetroffen wurde, wenn mehrfache Farbstoffe in Mikroteilchen eingebettet werden, ist die Veränderung der Farbstoffspektren. Im Speziellen wurde festgestellt, dass, wenn das Teilchen aus vernetztem Polystyrol zusammengesetzt ist, eine wesentliche Verbreiterung des Fluoreszenzemissionspeaks auftritt. Dies kann zu einer Überlappung der Spektren benachbarter Farbstoffe führen.
Ein Verfahren, das diese Probleme umgehen kann, ist das chemische Ankoppeln jeder Farbstoffsubstanz an die Teilchenoberfläche. Dieser Weg ist zum Beispiel in den US-Patenten 5,194,300 von Cheung, 4,774,189 von Schwartz offenbart, wobei ein oder mehrere Fluoreszenzfarbstoffe an die Teilchenoberfläche kovalent gebunden werden. Dies lässt jedoch das Farbstoffmolekül der Umgebung ausgesetzt, was zur Beschleunigung der Zersetzung durch Oxidation oder einen anderen chemischen Angriff führen kann. Ferner wird eine große Anzahl von Oberflächenbindungsstellen durch Farbstoff besetzt und stehen zur Konjugation von analytischen Molekülen als Reaktionsteilnehmer zur Durchführung der Tests nicht mehr zur Verfügung.
Deshalb ist es erwünscht, mehrfach gefärbte fluoreszierende Teilchen zu haben, welche die zuvor genannten Probleme vermeiden. Vorliegende Erfindung minimiert diese Komplikationen oder schließt sie aus, während die Verschiedenheit der Mehrfachfarbstoffteilchen aufrecht erhalten wird.
Demgemäß stellt vorliegende Erfindung einen neuen Artikel zur Verfügung, der ein Polymermikroteilchen umfasst, an dessen Oberfläche eine oder mehrere Populationen oder Sätze von fluoreszierend gefärbten Nanoteilchen gebunden sind. Alle Nanokugeln in einer gegebenen Population sind mit der gleichen Konzentration eines Farbstoffs gefärbt, und durch Koppeln einer zuvor festgelegten Anzahl dieser Nanokugeln an das Mikroteilchen, zusammen mit bekannten Mengen anderer, mit verschiedenen Farbstoffen gefärbten Nanokugeln, ergibt sich eine Mehrfachfluoreszenzmikrokugel. Durch Verändern der Menge und des Verhältnisses unterschiedlicher Populationen oder Sätze von Nanokugeln ist es möglich, eine große Anzahl diskreter Populationen von Trägerteilchen mit einzigartigen Emissionsspektren oder Fluroeszenzsignalen einzurichten und zu unterscheiden.
Masson et al. offenbart in US-Patent 4,279,617 Latexteilchen verhältnismäßig großen Durchmessers (zum Beispiel 0,79 μm) beschichtet mit einem analytischen Reaktanden, beispielsweise einem Allergen, entweder durch einfache Adsorption oder durch kovalentes Binden mit Cyanogenbromid oder hydroxyliertem Latex. Eine Probe menschlichen Serums von einer Person, die im Verdacht steht, eine allergische Reaktion zu haben, wird mit einer Suspension dieser Teilchen vermischt. Das Gemisch wird inkubiert, und Latexteilchen eines verhältnismäßig geringeren Durchmessers (zum Beispiel 0,08 μm) werden zugegeben. Diese kleineren Teilchen sind mit Anti-IgE- Antikörpern von Kaninchen beschichtet und, bei größeren Teilchen, bei denen IgE an das Allergen gebunden ist, binden sich diese kleinen Teilchen an diese Antikörper und bilden dank einer Agglomerationsreaktion sog. Agglutinationsteilchen, d. h. große Teilchen, die durch mehrere kleinere Teilchen umgeben sind. Diese Teilchen werden jedoch über eine nicht-kovalente Bindung untereinander gebunden, und die Agglomeration verläuft als Folge und führt zur Anwesenheit des Analyten von Interesse. Im Gegensatz hierzu erfordert der Artikel der vorliegenden Erfindung, dass er vor dem Nachweis eines Analyten von Interesse gebildet wird.
Obgleich der erfindungsgemäße Artikel ähnlich erscheinen könnte wie vorhandene Agglutinationsteilchen von Masson et al. und andere ähnliche Offenbarungen im Stand der Technik, sind diese von vorliegender Erfindung patentierbar verschieden, weil die Mittel und die Reihenfolge des Koppelns von Teilchen an Teilchen grundverschieden sind. Der Zweck des Agglutinationstests und die Mittel zum Nachweis sind auch drastisch verschieden. Deshalb sind die sich auf die Teilchenagglutinationsverfahren und -zusammensetzungen beziehenden Offenbarungen des Standes der Technik völlig irrelevant und ohne Beziehung zur vorliegenden Erfindung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß ist ein Ziel vorliegender Erfindung die Bereitstellung eines neuen Artikels, der ein Mikroteilchen umfasst, das an seiner Oberfläche eine oder mehrere Populationen von fluoreszierend gefärbten Nanoteilchen bereit stellt. Alle Nanokugeln in einer gegebenen Population sind mit der gleichen Konzentration eines Farbstoffs gefärbt, und durch Koppeln einer bekannten Menge dieser Nanokugeln an das Mikroteilchen, zusammen mit bekannten Mengen anderer, mit unterschiedlichen Farbstoffen gefärbter Nanokugeln, ergibt sich eine Mehrfachfluoreszenzmikrokugel. Durch Variieren der Menge und des Verhältnisses verschiedener Populationen von Nanosphären ist es möglich, eine große Anzahl von diskreten Populationen von Trägerteilchen mit einzigartigen Emissionsspektren einzurichten und zu unterscheiden. Die Trägerteilchen können auch gefärbt werden, um eine zusätzliche Farbe oder ein zusätzliches Signal bereitzustellen.
Polymere Mikroteilchen, die bei vorliegender Erfindung als Träger- oder Kernteilchen verwendet werden, haben einen Durchmesser von weniger als 1 mm, vorzugsweise einen Durchmesser im Bereich von etwa 0,1 bis 1.000 Mikrometer (μm). Obgleich das Mikroteilchen irgendeine Größe aufweisen kann, ist die bevorzugte Größe jedoch 1 bis 100 μm, bevorzugter 2 bis 50 μm, noch bevorzugter 3 bis 25 μm, insbesondere etwa 6 bis 12 μm.
Bevorzugte Größen für Nanoteilchen liegen im Bereich von etwa 1 Nanometer (nm) bis etwa 100.000 nm im Durchmesser. Optimal bevorzugte Durchmesser liegen im Bereich von etwa 10 und 1.000 nm, vorzugsweise innerhalb von 100 und 800 nm, bevorzugter innerhalb von 200 und 500 nm.
Ein weiteres Ziel vorliegender Erfindung ist die Bereitstellung von Nanokugeln sowie Trägerteilchen, welche vorzugsweise aus einem Polymermaterial, d.h. Polystyrol, bestehen. Jedoch sind auch folgende Polymermaterialien akzeptabel, welche umfassen, jedoch nicht hierauf beschränkt sind: bromiertes Polystyrol, Polyacrylsäure, Polyacrylnitril, Polyamid, Polyacrylamid, Polyacrolein, Polybutadien, Polycaprolacton, Polycarbonat, Polyester, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polydimethylsiloxan, Polyisopren, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid, Polyvinyltoluol, Polyvinylidenchlorid, Polydivinylbenzol, Polymethylmethacrylat, Polylactid, Polyglycolid, Poly(lactid-co-glycolid), Polyanhydrid, Polyorthoester, Polylphosphazen, Polyphosophaze, Polysulfon oder Kombinationen derselben. Andere Polymermaterialien, wie zum Beispiel Kohlehydrat, wie Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Agar, Gel, ein eiweißartiges Polymer, Polypeptid, eukaryotische und prokaryotische Zellen, Viren, Lipid, Metall, Harz, Latex, Kautschuk, Silikon, wie zum Beispiel Polydimethyldiphenylsiloxan, Glas, Keramik, Holzkohle, Kaolinit, Bentonit und dergl. können in gleicher Weise verwendet werden.
In diese Polymeren können auch ein Magnet oder ein aus der Gruppe ausgewähltes magnetisch ansprechbares Metalloxid eingearbeitet werden, das aus superparamagnetischem, paramagnetischem oder ferromagnetischem Metalloxid besteht.
Ein weiteres Ziel vorliegender Erfindung ist die Bereitstellung von Teilchen, welche etwa 0% bis 50% (Gewicht/Gewicht) eines Vernetzungsmittels, wie Divinylbenzol, Ethylenglycoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat oder N,N'-Methylen-bis-acrylamid oder andere funktionell gleichwertige bekannte Mittel enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind Kernmikrokugeln sowie -nanokugeln aus Polystyrol hergestellt und enthalten etwa 0% bis 30% Divinylbenzol.
Noch ein anderes Ziel vorliegender Erfindung ist die Bereitstellung von Teilchen, welche zusätzliche funktionelle Gruppen an der Oberfläche enthalten, wie zum Beispiel Carboxylate, Ester, Alkohole, Carbamide, Aldehyde, Amine, Schwefeloxide, Stickoxide oder Halogenide, die eine Bindung analytischer Reaktanden und/oder ein Binden von Teilchen an Teilchen erleichtern können.
Es ist noch ein weiteres Ziel vorliegender Erfindung, Verfahren bereit zu stellen zur Herstellung von Mikroteilchen durch kovalentes Koppeln oder irgendeines anderen Kopplungsmittels, wie zum Beispiel ionische Bindungen, Wasserstoffbindungen oder durch einfache Adsorption. Andere Kopplungsverfahren werden bereit gestellt, einschließlich des Koppelns durch eine Adsorption im Anschluss an ein Umgeben des Artikels der Erfindung mit einer polymeren Schale.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Farbstoffen, welche Fluoreszenzfarbstoffe sind. Vorzugsweise sind derartige Farbstoffe hydrophob und in der Lage, Polymerteilchen zu färben. Die bevorzugten Farbstoffe sind Cyaninfarbstoffe. Für spezielle Zwecke, wie zum Beispiel zum Markieren, können Markierungs- oder Nachweisreagenzien, d.h. ein Antikörper, hydrophile Farbstoffe, wie Fluoreszin (FITC) verwendet werden.
Auch ist ein Ziel der Erfindung, Farbstoffe mit Lichtemission bei einer Wellenlänge im Ultraviolett- oder sichtbaren Bereich zur Verfügung zu stellen, ebenso wie die Bereitstellung von Farbstoffen, die im Infrarot- oder nahen Infrarotbereich fluoreszieren.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Farbstoffen mit Lichtemission bei einer Wellenlänge von mehr als etwa 450 nm, vorzugsweise mehr als etwa 480 nm, bevorzugter mehr als etwa 500 nm. Die bevorzugten Farbstoffe sind Polymethincyanine oder -squaraine, welche Fluoreszenzlicht mit Wellenlängen im Bereich von 500 nm bis etwa 1.000 nm emittieren. Vorzugsweise werden diese Farbstoffe, wenn mehr als ein Farbstoff zum Färben von mehr als einer Population von Nanokugeln verwendet wird, derart ausgewählt, dass sie wesentlich verschiedene Emissionsspektren besitzen, vorzugsweise mit Emissionsmaxima, welche um mehr als 10 nm, bevorzugter mit Emissionsmaxima, die um mehr als 25 nm, getrennt sind, noch bevorzugter um mehr als 50 nm getrennt sind. Die Farbstoffe können ausgewählt werden, um Emissionsbanden aufzuweisen, welche zu im Handel erhältlichen Filtern passen, oder zum Nachweis von Mehrfachfluorophoren mit verschiedenen Erregungs- und Emissionsbanden.
Noch ein anderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Verwendung derartiger Teilchen für verschiedene diagnostische, analytische und industrielle bekannte Anwendungen. Ein wieder anderes Ziel vorliegender Erfindung ist die Bereitstellung eines zur Verwendung beim Nachweis der Analyte von Interesse geeigneten Satzes. Vorzugsweise enthält dieser Satz eine Reihe von Mikroteilchen mit angebrachten Nanoteilchen, die ein unterschiedliches Fluoreszenzsignal und auch einen analytischen Reaktanden aufweisen, welcher einer speziellen Bindung mit einem der Analyten von Interesse fähig ist. Der Satz enthält auch ein zweites Reagens, welches ein Reagens umfasst, das sich an den gleichen Analyten wie das analytische Reagens bindet, und dieser Satz kann auch eine fluoreszierende Markierung, ein Kompetitormolekül, ein Bezugsmaterial und andere Bestandteile enthalten, die als Standardreagenzien akzeptiert sind, wie zum Beispiel ein Waschpuffer, notwendige Kunststoffartikel usw.
Auch ist ein Ziel der Erfindung der Nachweis und die Analyse verschiedener Analyte, welche in einem weiteren Sinn ein Antigen, ein Antikörper (sowohl monoklonal als auch polyklonal), ein Rezeptor, ein Hapten, ein Enzym, ein Protein, ein Peptid, eine Nukleinsäure, ein Arzneimittel, ein Hormon, eine Chemikalie, ein Polymer, ein Pathogen, ein Toxin oder eine Kombination derselben sein können.
Ein weiteres Ziel vorliegender Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zum Nachweis von Mehrfachsubpopulationen von Analyten des Interesses in einer Probe unter Verwendung von mehrfach gefärbten Teilchen gemäß vorliegender Erfindung.
In Übereinstimmung mit den obigen und weiteren Zielen der Erfindung ist das bevorzugte Verfahren, in einer Probe Aspekte oder Teile von Analyten nachzuweisen, zu unterscheiden, einzuordnen, quantitativ zu erfassen (quantitate) und/oder zu analysieren, eine Strömungszytometrie.
Schließlich ist ein Ziel vorliegender Erfindung auch die Bereitstellung anderer Mittel zum Nachweis und zur Analyse, einschließlich – ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein – einer visuellen Prüfung, von Digital (CCD)-Kameras, Videokameras, eines fotografischen Films oder der Verwendung einer geläufigen Instrumentierung, wie zum Beispiel von Laserabtastvorrichtungen, Fluorometern, Luminometern, Fotodioden, Quantenzählern, Plattenlesern, Epifluoreszenzmikroskopen, Rastermikroskopen, konfokalen Mikroskopen, Kapillarelektrophoresedetektoren oder durch andere Vorrichtungen zur Verstärkung des Signals, wie zum Beispiel einer Fotoelektronen-Vervielfacherröhre oder eines anderen Lichtdetektors, der fähig ist, die Anwesenheit, Lage, Intensität, Erregungs- und Emissionsspektren, Fluorszenzpolarisation, Fluoreszenzhalbwertszeit und andere physikalische Eigenschaften des Fluoreszenzsignals nachzuweisen.
Bei einer besonderen Ausführungsform vorliegender Erfindung wird ein Artikel bereit gestellt, der ein Mikroteilchen mit einem ersten Durchmesser und eine Vielzahl von Nanoteilchen umfasst, die an der Perle angebracht sind und einen zweiten Durchmesser, der geringer als der erste Durchmesser ist. Bei vorliegender Ausführungsform der Erfindung tragen das Mikroteilchen, mindestens ein Teil der Nanoteilchen, oder beide, eine zuvor festgelegte Konzentration mindestens einer Art von Markierungsmolekülen, die zur Unterscheidung des Artikels von einem anderen Artikel geeignet sind, mit entweder einer unterschiedlichen, zuvor festgelegten Konzentration der zumindest einen Art von Markierungsmolekülen, eine zuvor festgelegte Konzentration einer oder mehrerer verschiedener Arten von Markierungsmolekülen oder beide, mit der Maßgabe, dass die zuvor festgelegte Konzentration im Bereich von Null bis zu einem Maximalwert liegen kann. Bei bevorzugten Ausführungsformen liegt die zuvor festgelegte Konzentration im Bereich eines etwas von Null verschiedenen Werts bis zum Maximalwert. Der Maximalwert ist durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt, einschließlich der physikalischen und chemischen Eigenschaften einer gegebenen Art von Markierungsmolekül, welche Eigenschaften das obere Ende der Konzentration der Markierungsmoleküle begrenzen können, die in das Mikroteilchen, Nanoteilchen oder beide eingeführt, eingearbeitet oder mit diesen verbunden werden können. Wenn das Markierungsmolekül einen Fluoreszenzfarbstoff umfasst, sind die Löslichkeit oder Spektraleigenschaften, einschließlich der Absorption- und/oder Emissionseigenschaften, eine der Eigenschaften des Farbstoffs, welche die maximale wirksame Konzentration bestimmen können. In einer alternativen Ausführungsform nähert sich der Maximalwert dem Sättigungspunkt der Markierungsmoleküle an der Oberfläche oder an zugänglichen Innenteilen des Mikroteilchens oder Nanoteilchens oder ist im wesentlichen diesem gleich.
Bei bevorzugteren Ausführungsformen der Erfindung ist die Anzahl oder Menge der Vielzahl von Nanoteilchen, die an das Mikroteilchen gebunden sind, auch zuvor festgelegt. Überdies ist in bestimmten Fällen die Mehrzahl von Nanoteilchen kovalent an das Mikroteilchen gebunden.
Andere Ziele der Erfindung sind für den Fachmann im Hinblick auf die im Vorliegenden zur Verfügung gestellte Offenbarung offensichtlich.
EINZELHEITEN SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bevor vorliegende Erfindung offenbart und beschrieben wird, ist zu verstehen, dass vorliegende Erfindung nicht auf die speziellen Verfahrensstufen und Materialien, die im Vorliegenden offenbar sind, begrenzt ist, da solche Verfahrensstufen und Materialien etwas variieren können. Es ist auch zu verstehen, dass die im Vorliegenden verwendete Terminologie lediglich zwecks Beschreibung besonderer Ausführungsformen benutzt wird und nicht zur Begrenzung beabsichtigt ist, da der Umfang vorliegender Erfindung nur durch die Patentansprüche und deren Äquivalente begrenzt ist.
Es muss darauf hingewiesen werden, dass die in vorliegender Beschreibung und den Patentansprüchen benutzten Einzahlformen „ein, eine" und „der, die, das" Mehrzahlformen umfassen, wenn der Inhalt klar nichts anderes vorschreibt. So kann zum Beispiel eine Bezugnahme auf ein Verfahren zum Färben „eines Teilchens" mit „einem Farbstoff" ein Gemisch aus einem oder mehreren Farbstoffen und ein oder mehrere Teilchen umfassen.
Teilchen
Es werden fluoreszierende Polymernanokugeln, die an Trägermikroteilchen gekoppelt sind, beschrieben. Durch Veränderung der Menge des Farbstoffs in den Nanokugeln werden fluoreszierend unterscheidbare Teilchengruppen erhalten. Die erwünschte Anzahl an das Mikroteilchen gebundener Nanokugeln, und die Verhältnisse von verschieden gefärbten Nanokugeln an der Oberfläche des Trägerteilchens werden gemäß dem besonderen Bedürfnis ausgewählt.
Bei vorliegender Erfindung benutzte Nanokugeln sind im Handel in Größen erhältlich, die im Bereich von etwa 10 Nanometer (nm) bis etwa 100.000 nm im Durchmesser liegen. Optimal bevorzugte Durchmesser sind innerhalb von etwa 10 bis 1.000 nm, vorzugsweise innerhalb 200 und 500 nm. Polymere Mikrokugeln, die bei vorliegender Erfindung als Trägerteilchen verwendet werden, an die Nanokugeln gebunden sind, liegen normalerweise im Größenbereich von 0,01 bis 1.000 Mikrometer (μm) im Durchmesser. Auch wenn das Mikroteilchen von einer beliebigen Größe sein kann, so ist die bevorzugte Größe jedoch 0,1 bis 500 μm, bevorzugter 1 bis 200 μm und am meisten bevorzugt 2 bis 12 μm. Die Teilchen können gleichmäßig (etwa von der gleichen Größe) oder von variabler Größe sein, so dass die Unterschiede durch größenabhängige Eigenschaften wie Lichtstreuung oder optische Brechung ermittelt werden können.
Teilchen werden aus irgendeinem regulär geformten Material hergestellt. Die bevorzugte Form ist kugelförmig; jedoch können Teilchen irgendeiner anderen Form benutzt werden, da dieser Parameter für die Natur der Erfindung unerheblich ist. Die Teilchenform kann als zusätzlicher Unterscheidungsparameter dienen, der durch Durchflusszytometrie unterschieden wird, wie zum Beispiel durch das Hochauflösungs-Schlitzabtastverfahren.
Üblicherweise werden diese Nanokugeln sowie Trägerteilchen aus dem gleichen Material, wie zum Beispiel Polystyrol oder Latex, hergestellt. Jedoch sind andere Polymermaterialien akzeptabel, einschließlich Polymere, die aus der chemischen Gruppe ausgewählt sind, welche aus Polymeren auf Kohlehydratbasis, polyaliphatischen Alkoholen, Poly(vinyl)polymeren, Polyacrylsäuren, polyorganischen Säuren, Polyaminosäuren, Copolymeren, Blockcopolymeren, tert.-Polymeren, Polyethern, natürlich vorkommenden Polymeren, Polyimiden, Tensiden, Polyestern, verzweigten Polymeren, cyclo-Polymeren, Polyaldehyden und deren Gemischen bestehen. Insbesondere werden bromiertes Polystyrol, Polyacrylsäure, Polyacrylnitril, Polyamid, Polyacrylamid, Polyacrolein, Polybutadien, Polycaprolacton, Polyester, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polydimethylsiloxan, Polyisopren, Polyurethan, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyridin, Polyvinylbenzylchlorid, Polyvinyltoluol, Polyvinylidenchlorid, Polydivinylbenzol, Polymethylmethacrylat, Polylactid, Polyglycolid, Poly(lactid-co-glycolid), Polyanhydrid, Polyorthoester, Polyphosphazen, Polyphosophaze oder deren Kombinationen bevorzugt. Repräsentative Kombinationspolymere, deren Polymerteilchen zusammengesetzt sind, umfassen zum Beispiel Poly(styrol-co-vinylbenzylchlorid-co-acrylsäure) (Molverhältnis 85 : 10 : 5), Poly(styrol-co-acrylsäure) (Molverhältnis 99 : 1), Poly(styrol-co-methacrylsäure) (Molverhältnis 90 : 10), Poly(styrol-co-acrylsäure-co-m&p-divinylbenzol) (Molverhältnis 89 : 10 : 1), Poly(styrol-co-2-carboxyethylacrylat) (Molverhältnis 90 : 10), Poly(methylmethacrylat-co-acrylsäure) (Molverhältnis 70 : 30) und Polystyrol-co-butylacrylat-co-methacrylsäure) (Gewichtsverhältnis 45 : 45 : 10). Die meisten Perlen, die aus synthetischen Polymeren wie Polystyrol, Polyacrylamid, Polyacrylat oder Latex gebildet sind, sind nunmehr im Handel von zahlreichen Quellen wie Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA) und LKB Produkter (Stockholm, Schweden) erhältlich. Aus natürlichen Makromolekülen und Teilchen wie Agarose, vernetzte Agarose, Globulin, Deoxyribosenukleinsäure und Liposomen gebildete Perlen sind im Handel von Quellen erhältlich wie Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, NJ, USA) und IBF (Frankreich). Aus Copolymeren von Polyacrylamid und Agarose gebildete Perlen sind im Handel von den Firmen IBF und Pharmacia erhältlich.
In diese Polymeren kann auch ein Magnet oder ein magnetisch erregbares Metalloxid eingearbeitet sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem supermagnetischen, paramagnetischen, oder ferromagnetischen Metalloxid besteht. Magnetische Perlen sind im Handel von der Firma Dynal Inc. (Great Neck, NY, USA) erhältlich oder können unter Anwendung bekannter Verfahren hergestellt werden, wie sie zum Beispiel in den US-Patenten 4,358,388; 4,654,267; 4,774,265; 5,320,944 und 5,356,713 offenbart sind.
In gleicher Weise können andere Materialien, wie zum Beispiel ein Kohlehydrat wie Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, eiweißartige Polymere, Polypeptide, eukaryotische und prokaryotische Zellen, Viren, Lipid, Metall, Harz, Kautschuk, Kieselsäure, Silikon, beispielsweise Polydimethyldiphenylsiloxan, Glas, Keramik und dergleichen verwendet werden.
Nanoteilchen sind vorzugsweise aus dem gleichen Material wie die Mikroteilchen hergestellt. Erforderlichenfalls können sie jedoch auch aus unterschiedlichem Material hergestellt sein. Es ist zu verstehen, dass in vorliegender Beschreibung die Begriffe „erste, erster, erstes" und „zweite, zweiter, zweites", wenn sie auf Polymergattungen angewandt werden, die sich aus Mikroteilchen und Nanoteilchen zusammensetzen, nur zu Identifikationszwecken benutzt werden und keine Reihenfolge der Bevorzugung einbeziehen.
Die Mikrokugeln enthalten auch etwa 0% bis 50% eines Vernetzungsmittels, wie zum Beispiel Divinylbenzol, Ethylenglycoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat oder N,N'-Methylen-bis-acrylamid oder andere funktionell gleichwertige bekannte Mittel. Das Vernetzen eines Kohlehydratpolymeren wie Hydroxypropylcellulose kann mit Adipinsäure, Sebacinsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, 1,2,3,4-Butantetracarbonsäure oder 1,10-Decandicarbonsäure erreicht werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Kernmikrokugeln und Nanokugeln aus Polystyrol hergestellt und enthalten etwa 0% bis 30% Divinylbenzol.
Die Teilchen können zusätzliche funktionelle Gruppen an der Oberfläche aufweisen, um die Befestigung und Bindung zu erleichtern. Diese Gruppen können Carboxylate, Ester, Alkohole, Carbamide, Aldehyde, Amine, Schwefeloxide, Stickoxide oder Halogenide umfassen. Carboxylierte Latexteilchen wurden zur Herstellung von diagnostischen Reagenzien benutzt, wie zum Beispiel in US-Patent 4,181,636 beschrieben. Wie dort ausgeführt, umfasst das herkömmliche Verfahren zur kovalenten Bindung einer immunologisch reaktionsfähigen Gattung an die Teilchen mit Carboxylgruppen an der Oberfläche die Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids. Für viele praktische Anwendungen ist es kritisch, dass die Polymerteilchen Carboxylgruppen an der Oberfläche besitzen, die zur Befestigung der reaktiven aminhaltigen oder sulfhydrylhaltigen Verbindung zugänglich sind. Derartige Gruppen werden vorzugsweise den Teilchen zugegeben, indem man in die Polymeren derartige Gruppen enthaltende Monomere einarbeitet (zum Beispiel Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure und dergl.). Sie können aber auch zu den Teilchen durch weitere chemische Umsetzung eines Polymeren mit anderen reaktiven Vorläufergruppen, die in Carboxylgruppen übergeführt werden können (beispielsweise durch Hydrolyse von Anhydriden wie Maleinsäureanhydrid oder durch Oxidation von Methylolgruppen an der Oberfläche oder Aldehydendgruppen) zugegeben werden. Andere Verbindungen wie Diamine, Dihydrazide, Mercaptoalkylamine und Dimercaptane können als verbindende Reste für eine spätere Anbindung von Arzneimitteln, Enzymen oder anderen reaktionsfähigen Gattungen, wie zum Beispiel Nanokugeln, verwendet werden. Obgleich das bevorzugte Verfahren zum Anbringen oder Verbinden dasjenige durch eine kovalente Bindung ist, können in gleicher Weise andere Verfahren, wie zum Beispiel eine Adsorption, angewandt werden. Andere neue Verfahren, wie zum Beispiel das Umgeben von Mikroteilchen-Nanoteilchen-Komplexen durch eine Polymerschale sind ebenfalls akzeptabel.
Farbstoffe
Bei vorliegender Erfindung verwendete Fluoreszenzfarbstoffe sind diejenigen der allgemeinen als Cyaninfarbstoffe bekannten Klasse mit Emissionswellenlängen zwischen 550 nm und 900 nm. Diese Farbstoffe können Methingruppen enthalten, und deren Anzahl beeinflusst die Spektraleigenschaften des Farbstoffs. Die Monomethinfarbstoffe, welche Pyridine sind, haben typischerweise eine blaue bis blau-grüne Fluoreszenzemission, während die Chinoline eine grüne bis gelb-grüne Fluoreszenzemission besitzen. Die Trimethinfarbstoffanalogen sind im wesentlichen in Richtung der roten Wellenlängen verschoben, und die Pentamethinfarbstoffe sind noch weiter verschoben und zeigen oftmals eine Fluoreszenzemission im Infrarot (vgl. zum Beispiel US-Patent 5,760,201).
Jedoch kann jeder Farbstoff, der in einem organischen Lösungsmittel löslich ist, verwendet werden. Fluoreszenzfarbstoffe auf Basis von Squarsäure (squaric acid) können nach in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werden; vgl. zum Beispiel Sprenger et al., Angew. Chem., 79, 581 (1967); Angew. Chem., 80, 541 (1968); und Maaks et al., Angew. Chem. Intern., Ausg. 5, 888 (1966). Ferner können unsymmetrisch substituierte Squarsäureverbindungen nach Verfahren hergestellt werden, wie zum Beispiel denjenigen, welche von Law et al., J. Org. Chem. 57, 3278 (1992), beschrieben sind. Spezielle Verfahren zur Herstellung einiger solcher Farbstoffe sind gut bekannt und können z. B. in den US-Patenten 5,795,981; 5,656,750; 5,492,795; 4,677,045; 5,237,498 und 5,354,873 gefunden werden. Die praktische Verwendung der zuvor beschriebenen Fluoreszenzfarbstoffe, wie zum Beispiel von Phthalocyaninen, 2,3- Naphthalocyaninen, Squarainen und Crotonsäurederivaten ist in US-Patent 5,525,516 von Krutak et al. beschrieben.
Zusätzlich zu den bei dieser bevorzugten Ausführungsform verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen können ferner verwandte Farbstoffe aus Cyclobutendionderivaten, substituierten Cephalosporinverbindungen, fluorierten Squarainzusammensetzungen, symmetrischen und unsymmetrischen Squarainen, Alkylalkoxysquarainen oder Squaryliumverbindungen ausgewählt werden. Einige dieser Farbstoffe können im nahen Infrarot sowie bei Infrarot-Wellenlängen fluoreszieren, welche sich wirksam in den Bereich von Emissionsspektren bis zu etwa 1.000 nm ausdehnen. Zusätzlich zu Squarainen, d.h. Derivaten von Squarsäure, können auch hydrophobe Farbstoffe wie Phthalocyanine und Naphthalocyanine, die bei längeren Wellenlängeren fluoreszieren, ausgewählt werden. Andere Klassen von Fluorochromen sind in gleicher Weise zur Verwendung als Farbstoffe gemäß vorliegender Erfindung brauchbar. Einige dieser Farbstoffe werden hiermit aufgelistet: 3-Hydroxypyren-5,8,10-trisulfonsäure, 5-Hydroxytryptamin, 5-Hydroxytryptamin (5-HT), saures Fuhsin, Acridinorange, Acridinrot, Acridingelb, Acriflavin, AFA (Acriflavin Feulgen SITSA), Alizarin-Complexon, Alizarinrot, Allophycocyanin, ACMA, Aminoactinomycin D, Aminocumarin, Anthroylstearat, aryl- oder heteroarylsubstitut. Polyolefin, Astrazon-Brillantrot 4G, Astrazonorange R, Astrazonrot 6B, Astrazongelb 7GLL, Atabrin, Auramin, Aurophosphin, Aurophosphin G, BAO 9 (Bisaminophenyloxadiazol), BCECF, Berberinsulfat, Bisbenzamid, BOBO 1, Blancophor FFG-Lösung, Blancophor SV, Bodipy FI, BOPRO 1, Brillantsulfoflavin FF, Calcienblau, Calciumgrün, Calcofluor RW-Lösung, Calcofluorweiß, Calcophorweiß ABT-Lösung, Calcophorweiß-Standardlösung, Carbocyanin, Carbostyryl, Cascadblau, Cascadgelb, Catechinamin, Chinacrin, Coriphosphin O, Cumarin, Cumarin-Phalloidin, CY3.1 8, CY5.1 8, CY7, Dans(1-Dimethylaminonaphalin-5-sulfonsäure), Dansa(Diaminonaphthylsulfonsäure), Dansyl NH-CH₃, DAPI, Diaminophenyloxydiazol (DAO), Dimethylamino-5-sulfonsäure, Dipyrromethenbordifluorid, Diphenyl Brillantflavin 7GFF, Dopamin, Eosin, Erythrosin ITC, Ethidiumbromid, Euchrysin, FIF (durch Formaldehyd bewirkte Fluoreszenz), Flazo-Orange, Fluo 3, Fluorescamin, Fura-2, Genacryl Brillantrot B, Genacryl Brillantgelb 10GF, Genacrylpink 3G, Genacrylgelb 5GF, Gloxalsäure, Granularblau, Hämatoporphyrin, Hoechst 33258, Indo-1, Intraweiß Cf Liquid, Leucophor PAF, Leucophor SF, Leucophor WS, Lissamin-Rhodamin B200 (RD200), Lucifergelb CH, Lucifergelb VS, Magdalarot, Marinablau, Maxilon Brillant-Flavin 10 GFF, Maxilon Brillant-Flavin 8 GFF, MPS (Methylgrün Pyronin-Stilbene), Mithramycin, NBD Amin, Nilrot, Nitrobenzoxadidol, Noradrenalin, Nuklear-Echtrot, Nuklear-Gelb, Nylosan Brillant Flavin E8G, Oregongrün, Oxazin, Oxazol, Oxadiazol, Pazifikblau, Pararosanilin (Feulgen), Phorwite AR-Lösung, Phorwite BKL, Phorwite Rev, Phorwite RPA, Phosphin 3R, Phthalocyanin, Phycoerythrin R, Polyazaindacen Pontochrom-Blauschwarz, Porphyrin, Primulin, Prociongelb, Propidiumjodid, Pyronin, Pyronin B, Pyrozal Brillant Flavin 7GF, Chinacrin Mustard, Rhodamin 123, Rhodamin 5 GLD, Rhodamin 6G, Rhodamin B, Rhodamin B 200, Rhodamin B Extra, Rhodamin BB, Rhodamin BG, Rhodamin WT, Bengalrosa, Serotonin, Sevron Brillantrot 2B, Sevron Brillantrot 4G, Sevron Brillantrot B, Sevron-Orange, Sevron-Gelb L, SITS (Primulin), SITS (Stilben-isothiosulfonsäure), Stilben, Snarf 1, Sulpho Rhodamin B Can C, Sulpho Rhodamin G Extra, Tetracyclin, Texasrot, Thiazinrot R, Thioflavin S, Thioflavin TCN, Thioflavin 5, Thiolyt, Thiozol-Orange, Tinopol CBS, TOTO 1, TOTO 3, Echtblau, Ultralit, Uranin B, Uvitex SFC, Xylolorange, XRITC, YO PRO 1 oder Kombinationen hiervon. Gegebenenfalls enthalten solche Farbstoffe funktionelle Gruppen, welche der Bildung eines stabilen Fluoreszenzprodukts mit funktionellen Gruppen fähig sind, die typischerweise in Biomolekülen gefunden werden, oder Polymere, einschließlich aktivierte Ester, Isothiocyanate, Amine, Hydrazine, Halogenide, Säuren, Azide, Maleimide, Alkohole, Acrylamide, Halogenacetamide, Phenole, Thiole, Säuren, Aldehyde und Ketone.
Der Fachmann weiß gewiss, welcher unter derartigen Farbstoffen auszuwählen ist, solange die erwünschten Emissions- und Absorptionseigenschaften sowie ihre hydrophoben Eigenschaften zweckmäßig sind. Die Spektraleigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe sollten hinsichtlich der Erregungswellenlängen und Intensität Fluorescein oder Rhodamin-Derivaten ausreichend ähnlich sein, um die Verwendung der gleichen Durchflusszytometrievorrichtung zu erlauben. Jedoch wird bevorzugt, dass die Farbstoffe in organischen Lösungsmitteln eine höhere Löslichkeit, eine verbesserte Fotostabilität und verbesserte Quantenausbeuten besitzen.
Bevorzugter haben die Farbstoffe die gleichen oder sich überlappenden Erregungsspektren, besitzen jedoch unterscheidbare Emissionsspektren. Zum Nachweis des Unterschieds in den Spektraleigenschaften zwischen den beiden Farbstoffen kann ein beliebiges Nachweissystem benutzt werden, einschließlich eines Festzustandsdetektors, einer Fotovervielfacherröhre, eines fotografischen Films oder des Auges, von denen jedes zusammen mit zusätzlichen Instrumenten benutzt werden kann, wie zum Beispiel einem Spektrometer, Luminometermikroskop, Plattenleser, Fluoreszenzabtaster, Durchflusszytometer oder einer Kombination derselben, um das Nachweissystem zu vervollständigen. Vorzugsweise werden solche Farbstoffe ausgewählt die wesentlich unterschiedliche Emissionsspektren besitzen, vorzugsweise mit um mehr als 10 nm getrennten Emissionsmaxima, bevorzugter mit um mehr als 25 nm getrennten . Emissionsmaxima, noch mehr bevorzugt um mehr als 50 nm getrennten Emissionsmaxima. Wenn die Differenzierung zwischen den beiden Farbstoffen durch visuelle Prüfung erreicht wird, haben die beiden Farbstoffe vorzugsweise Emissionswellenlängen von wahrnehmbar verschiedenen Farben, um die visuelle Urteilskraft zu erhöhen. Wenn es erwünscht ist, zwischen den beiden Farbstoffen unter Anwendung instrumenteller Verfahren zu unterscheiden, ermöglichen die verschiedensten Filter und Beugungsgitter einen unabhängigen Nachweis der jeweiligen Emissionsmaxima. Wenn die beiden Farbstoffe so ausgewählt sind, dass sie ähnliche Emissionsmaxima besitzen, kann eine instrumentelle Unterscheidung erhöht werden, indem man gewährleistet, dass die Emissionsspektren beider Farbstoffe ähnliche integrierte Amplituden, ähnliche Bandbreiten besitzen, und der optische Durchsatz des instrumentellen Systems durch den Emissionsbereich der beiden Farbstoffe äquivalent ist. Eine instrumentelle Unterscheidung kann auch erhöht werden, indem man Farbstoffe mit engen Bandbreiten anstelle von breiten Bandbreiten auswählt, jedoch müssen derartige Farbstoffe notwendigerweise eine hohe Amplitudenemission besitzen oder in einer ausreichenden Konzentration vorhanden sein, so dass der Verlust an integrierter Signalstärke für den Signalnachweis nicht nachteilig ist.
Färbeverfahren
Die Technologie, welche dem Fachmann die Erstellung einer Reihe von mehrfach gefärbten, fluoreszierenden Teilchen mit einmaligen Fluoreszenzeigenschaften und die Verwendung derartiger Teilchen für eine Mehrfach-Parameter-Analyse einer Vielzahl von Analyten ermöglicht, ist offenbart. Gemäß Technologie können sowohl Mikroteilchen als auch Nanoteilchen einem fluoreszierenden Färben mit unterschiedlichen Farbstoffen unterzogen werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform werden die Nanoteilchen gefärbt und bevorzugter werden mehr als eine Gruppe von Nanoteilchen bereit gestellt, welche mit einem oder mehreren unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt sind. Ein Fluoreszenzfärben von polymeren Teilchen kann nach einem der Verfahren erreicht werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Drei unterschiedliche Mittel zur Herstellung von Fluoreszenzteilchen wurden im Stand der Technik offenbart, umfassend: (i) eine kovalente Befestigung von Farbstoffen an der Oberfläche des Teilchens, (ii) eine innere Einverleibung von Farbstoffen während der Teilchenpolymerisation und (iii) ein Färben nachdem die Teilchen schon polymerisiert wurden.

(i) Die US-Patente 5,194,300 von Cheung und 4,774,189 von Schwanz offenbaren zum Beispiel fluoreszierende Mikroteilchen, die durch kovalente Befestigung von einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen an ihrer Oberfläche beschichtet sind;
(ii) die US-Patente 5,073,498 von Schwanz und 4,717,655 von Fulwyler offenbaren während der Teilchenpolymerisation zugegebene Fluoreszenzfarbstoffe;
(iii) das Prinzip des dritten Verfahrens, d. h. des inneren Einbettens oder Diffundierens eines Farbstoffs, nachdem ein Teilchen schon polymerisiert wurde, wurde ursprünglich von L. B. Bangs (Uniform Latex Particles, Seragen Diagnostics Inc. 1984, S. 40) beschrieben. US-Patent 5,723,218 von Haugland et al. offenbart das diffuse Färben von Mikroteilchen mit einem oder mehreren Dipyrromethenbordifluorid-Farbstoffen unter Anwendung eines Verfahrens, das im wesentlichen dem Bangs-Verfahren ähnlich ist. Die Kombination der obigen Verfahren ist auch möglich, und diese Beispiele sind mit der Absicht einer Veranschaulichung, jedoch nicht einer Begrenzung, angeboten. Ein derartiges Verfahren ist im Folgenden beschrieben: Eine 1%ige (Gewicht/Gewicht) Lösung von Nanokugeln (mit einem Durchmesser von 300 nm, aus aminofunktionalisiertem Polystyrol) wird in einem Rundkolben gerührt. Dann wird eine Lösung des Farbstoffs in einem organischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel Chloroform, zugegeben. Wenn die Farbstofflösung durch die Nanokugeln nicht mehr absorbiert wird, wird die Zugabe des Farbstoffs angehalten, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt.

Bei einer anderen Ausführungsform werden zwei Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, zum Beispiel roter Squarainfarbstoff, der 1,3-Bis[(1,3-dihydro-1,3,3-trimethyl-2H-indol-2-yliden)methyl]-2,4-dihydroxycyclobutendiylium, bis (inneres Salz) ist, und oranger Squarainfarbstoff, der 2-(3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)-4-(3,5-dimethyl-2H-pyrrol-2-yliden)-3-hydroxy-2-cyclobuten-1-on ist. Diese Farbstoffe werden zum Färben zweiter getrennter Populationen von Nanokugeln verwendet. Alternativ werden eine Population von Nanokugeln und eine Trägermikrokugel gefärbt. Als andere Alternative werden zwei Farbstoffe bei unterschiedlichem Verhältnis innerhalb des gleichen Teilchens einer gegebenen Population kombiniert.
Ein optimales Färben mit einem speziellen Farbstoff hängt von der physikalischen und chemischen Natur des einzelnen Farbstoffs oder Polymersubstrats und dem Farbstoffmedium sowie der festgesetzten Eigenschaft ab. Die Inkubationszeiten können in breitem Rahmen schwanken, je nach den erwünschten Eigenschaften, Konzentration des Farbstoffs und den Teilchen und Reaktionsbedingungen. Die optimale Zeit ist üblicherweise die, die für den Farbstoff in der benutzten Konzentration erforderlich ist, um das höchste spezifische Signal zu erreichen, unter Vermeidung eines Abbaus des Farbstoffs über die Zeit und unter Minimierung aller anderen unerwünschten Fluoreszenzsignale infolge des Farbstoffs.
Die Farbstoffgesamtmenge liegt zwischen etwa 0,00001 Gew.-% und 15 Gew.-%, bezogen auf das Teilchengewicht. Diese Begrenzung ist jedoch von geringer Auswirkung auf vorliegende Erfindung, solange das mit den Farbstoffen imprägnierte Teilchen stabil und für seinen beabsichtigten Zweck brauchbar ist.
Beide Farbstoffe werden vorzugsweise bei der gleichen Absorptionswellenlänge, zum Beispiel im Bereich von Ultraviolett bis etwa 800 nm, erregt und emittieren Fluoreszenzlicht bei zwei unterschiedlichen, im wesentlichen nicht-überlappenden Wellenlängen, welche voneinander um mindestens 10 nm, vorzugsweise 30 nm und am meisten bevorzugt um mindestens 50 nm, auseinander liegen. Beispielsweise ist der Emissionspeak des Farbstoffs Nr. 1 bei 585 nm, während die Spitzenemission des Farbstoffs Nr. 2 bei 630 nm liegt.
Alternativ wird der Farbstoff der Erfindung ausgewählt, um eine nachweisbare Reaktion zu ergeben, welche sich von derjenigen anderer Reagenzien unterscheidet, deren Verwendung in Kombination mit den vorliegenden Farbstoffen erwünscht ist. Beispielsweise können Farbstoffe, welche Komplexe bilden, die eine Erregung oberhalb von 600 nm erlauben, in Kombination mit üblicherweise verwendeten fluoreszierenden Antikörpern benutzt werden, wie zum Beispiel mit solchen, die mit Fluoresceinisothiocyanat oder Phycoerythrin markiert wurden.
Zum Nachweis der Unterschiede in den Spektraleigenschaften zwischen Farbstoffen mit unterschiedlichen Empfindlichkeitsgraden kann irgendein Fluoreszenznachweissystem (einschließlich einer visuellen Überprüfung) verwendet werden. Derartige Unterschiede umfassen, sind jedoch nicht hierauf begrenzt, einen Unterschied in den Erregungsmaxima, einen Unterschied in den Emissionsmaxima, einen Unterschied in den Fluoreszenzhalbwertszeiten, einen Unterschied in der Fluoreszenzemissionsintensität bei der gleichen Erregungswellenlänge oder bei einer verschiedenen Wellenlänge, einen Unterschied im Absorptionsvermögen, einen Unterschied in der Fluoreszenzpolarisation, einen Unterschied in der Fluoreszenzerhöhung in Kombination mit Zielmaterialien, oder eine Kombination derselben. Der nachweisbar unterschiedliche Farbstoff ist gegebenenfalls einer der Farbstoffe der Erfindung mit verschiedenen Spektraleigenschaften und verschiedener Selektivität. In einem Erfindungsaspekt haben der Farbstoffteilchen-Komplex und die zusätzlichen Nachweisreagenzien die gleichen oder sich überlappende Erregungsspektren, besitzen jedoch sichtbar unterschiedliche Emissionsspektren, voneinander getrennte Emissionsmaxima in der Regel um > 10 nm, vorzugsweise > 20 nm, bevorzugter > 50 nm, Eine gleichzeitige Erregung sämtlicher Fluoreszenzreagenzien kann eine Erregung der Probe bei einer Wellenlänge erfordern, welche für jedes Reagens einzeln weniger als optimal, jedoch für die Kombination von Reagenzien optimal ist. Alternativ kann das zusätzliche Reagens bzw. die zusätzlichen Reagenzien gleichzeitig oder nacheinander bei einer Wellenlänge erregt werden, die sich von derjenigen unterscheidet, welche zur Erregung des vorliegenden Farbstoffs verwendet wird. Bei noch einer anderen Alternative werden ein zusätzliches Reagens oder mehrere zusätzliche Reagenzien zum Löschen oder teilweise Löschen der Farbstoffemission verwendet.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden zum Löslichmachen der Farbstoffe chlorierte Lösungsmittel, bevorzugter Chloroform, verwendet. Jedoch werden geeignete Lösungsmittel auf Basis ihrer Fähigkeit, die spezielle Klasse hydrophober Farbstoffe von Interesse löslich zu machen, ausgewählt. Die Lösungsmittel können Acyl-, aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder heterocyclische Kohlenwasserstoffe sein; die Lösungsmittel können oder auch nicht Halogene, Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff und/oder Phosphor als Endgruppen oder als integrale Teile eines Rings oder einer Kette aufweisen. Im Speziellen können Lösungsmittel wie Alkohol, Ethylacetat, Toluol, Xylol, Hexan, Pentan, Benzol, Ether, Aceton, Öl, Tetrachlorkohlenstoff, Schwefelkohlenstoff, DMSO oder Methylenchlorid verwendet werden. Andere bekannte Lösungsmittel können benutzt und unter verschiedenen, im Merck Index (11. Auflage, vgl. Abschnitt MISC-63–68) aufgelisteten Lösungsmittel ausgewählt werden.
Die erhaltenen gefärbten Nanokugeln können sodann an die gefärbten oder ungefärbten Mikroteilchen nach einer der gut bekannten Kopplungsreaktionen gebunden werden, wie zum Beispiel durch ein Carbodiimid-Koppeln (vgl. nachfolgend). Andere Kopplungsverfahren unter Verwendung von Carboxylaten, Estern, Alkoholen, Carbamiden, Aldehyden, Aminen, Schwefeloxiden, Stickoxiden oder Halogeniden können angewandt werden, ebenso wie gut bekannte Verfahren.
Verfahren der Verwendung des erfindungsgemäßen Artikels
Vorliegende Erfindung stellt einen fluoreszierenden Polymerartikel zur Verfügung, der ein Trägermikroteilchen, das ein oder mehrere Mikroteilchen mit Mehrfachfluoreszenzsignalen trägt, zur Verfügung. Gegebenenfalls kann das Trägermikroteilchen der Erfindung ebenfalls mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff gefärbt sein. Um einen derartigen Artikel zu erhalten, wird ein Trägerteilchen (kovalent oder durch Adsorption) mit einer Mehrzahl von kleineren fluoreszierenden Teilchen (Nanoteilchen) mit einer mittleren Größe von etwa 100 bis 500 Nanometer im Durchmesser, ungeachtet der Form und Zusammensetzung, beschichtet.
Der Artikel kann ferner durch eine dünne Polymerschale beschichtet oder umgeben werden, die auf einem solchen Weg ausgewählt wird, dass sie die Lichtabsorption und die Emissionseigenschaften nicht beeinflusst. Dies wird nach einer der beiden getrennten, im Folgenden beschriebenen Verfahren erreicht.
Die fluoreszierenden Nanoteilchen gemäß vorliegender Erfindung können hergestellt werden, indem man einen einzigen Fluoreszenzfarbstoff einarbeitet und eine oder mehrere Populationen von Nanoteilchen bei verschiedenen Verhältnissen kombiniert. Alternativ kann zum Erhalt von Mehrfachfluoreszenznanoteilchen eine Kombination von zwei oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen innerhalb des gleichen Teilchens verwendet werden. Die Fluoreszenzintensität dieser fluoreszierenden Nanoteilchen kann eingestellt werden, indem man die Menge des eingearbeiteten Fluoreszenzfarbstoffs variiert. Die Oberfläche beider Arten von Teilchen kann ferner modifiziert werden, um die gewünschten Oberflächeneigenschaften bereit zu stellen, welche eine Befestigung funktioneller Gruppen oder chemischer Bindungen ermöglicht.
Zusätzlich zu Zwecken der Durchflusszytometrie-Eichung sind diese fluoreszierenden Teilchen mit diesen Eigenschaften für die verschiedensten biomedizinischen Anwendungen brauchbar. Die Analysemethode wird ebenfalls zur Verfügung gestellt, welche die Verwendung von mehrfach gefärbten fluoreszierenden Mikroteilchen, die nach vorliegender Erfindung erhalten wurden, zugrunde liegt. Wenn jede derartige Population von Mikroteilchen, die durch mindestens zwei Fluoreszenzsignale gekennzeichnet sind, mit einem analytischen Reaktanden kombiniert wird, der einer Bindung eines spezifischen Analyten von Interesse in einer klinischen Probe oder Testprobe fähig ist, wird ein mächtiges analytisches Werkzeug erhalten, das qualitative und quantitative Testergebnisse zur Verfügung stellen kann. Um eine richtige Mehrfachanalyse einer Vielzahl von Analyten in einer Probe zu erhalten, wird eine dritte Art von Fluoreszenzsignal, zum Beispiel ein grünes Fluoreszenzsignal (FITC), bereit gestellt, das üblicherweise in einem Markierungsreagens gefunden wird, welches einer Bindung des Analyten von Interesse fähig ist. Das Markierungsreagens, wie im Vorliegenden definiert, hat somit zwei Funktionen: die Fähigkeit, sich mit dem Analyten umzusetzen, und die Fähigkeit, ein Fluoreszenzsignal zu liefern, das von dem Fluoreszenzsignal des Artikels der Erfindung unterschiedlich ist. Ein üblicher Durchflusszytometer ist fähig, Spektraleigenschaften (Fluoreszenzsignale) von bis zu 20.000 Teilchen pro Sekunde zu analysieren und kann verlässliche quantitative Daten in Echtzeitmaßstab bereitstellen. Somit werden durch vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von mehrfach gefärbten Mikroteilchen, die Mikroteilchen selbst, Mehrfachgruppen derartiger Mikroteilchen und Mehrfachverfahren zum Analysieren einer Vielzahl von Analyten in Proben beansprucht.
Ein fluoreszierender Artikel gemäß der Erfindung kann zum passiven oder kovalenten Koppeln von biologischem Material, d. h. eines Analyten oder eines analytischen Reagens, wie zum Beispiel von Haptenen, Antigenen, Antikörpern, Enzymen oder Nukleinsäuren, verwendet werden und für verschiedene Arten von Analytentests, wie zum Beispiel Immunassays, Nukleinsäuretests (DNA- oder RNA-Tests) zur Affinitätsreinigung, Zelltrennung und andere medizinische, diagnostische und industrielle Anwendungen benutzt werden.
Es existiert eine große Anzahl von Protokollen zum Nachweis der verschiedenen Analyte von Interesse, einschließlich Proteinen von 100 oder mehr Aminosäuren, Peptiden von weniger als 100 Aminosäuren, Polysacchariden, Nukleinsäuren, organischen Arzneimitteln, anorganischen Arzneimitteln, Zellen und Gewebe. Die Protokolle können die Verwendung eines signalbildenden Systems umfassen, das ein markiertes Konjugat umfasst, welches direkt oder indirekt nachgewiesen wird. Diese Verfahren können Farbstoffe, Enzyme, Enzymsubstrate oder Cofaktoren, Enzyminhibitoren, Fluoreszenzmittel, Chemilumineszenzmittel, Teilchen oder dergl. benutzen.
Beispielsweise kann der Analyt und Analytenreaktandenpaare aus einer der folgenden Kombinationen ausgewählt werden, in denen eines der beiden Glieder des Paars der Analyt und das andere der Bindungspartner sein kann, wie zum Beispiel Antigen und spezifischer Antikörper; Hormon und Hormonrezeptor; Hapten und Antihapten; Polynukleotid und Komplimentärpolynukleotid; Polynukleotid und das Polynukleotid bindende Protein; Biotin und Avidin oder Streptavidin; Enzym und Enzymcofaktor; sowie Lectin und spezielles Kohlenhydrat. Der Begriff Analyt, wie er im Vorliegenden benutzt wird, ist eine zu messende Verbindung oder Zusammensetzung, die ein- oder mehrwertig ist, d. h. die eine oder eine Vielzahl von Hapten- und Antigen-Determinantenstellen besitzt, eine einzige Verbindung oder eine Vielzahl von Verbindungen, welche mindestens eine gemeinsame Epitopen- oder Determinantenstelle teilt; oder ein Rezeptor. Der Begriff Rezeptor, wie er im Vorliegenden verwendet wird, ist eine makromolekulare Verbindung oder Zusammensetzung, die fähig ist, eine spezielle räumliche oder polare Organisation eines Moleküls, d. h. eine Epitopen- oder Determinantenstelle, zu erkennen (oder die eine erhöhte Bindungsaffinität zu dieser besitzt). Beispielhafte Rezeptoren umfassen natürlich vorkommene Rezeptoren, wie zum Beispiel Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Immunoglobulin (Fab)-Fragmente, Lektine, verschiedene an der Oberfläche von Zellen gefundene Proteine (Cluster von Differenzierungs- oder CD-Molekülen) und dergl. CD-Moleküle bezeichnen bekannte und unbekannte Proteine an der Oberfläche von eukaryotischen Zellen, zum Beispiel ist CD4 das Molekül, welches in erster Linie Helfer-T-Lymphozyten definiert. Der Begriff Antikörper wird in diesem Fall als beispielhaft für einen Rezeptor benutzt, allgemeiner zur Bezeichnung eines Rezeptors. Der Begriff Ligand ist seinerseits jede Verbindung oder Substanz, für die ein Rezeptor natürlich existiert oder hergestellt werden kann.
Die Haptene können natürlich vorkommende Hormone, natürlich vorkommende Arzneimittel, synthetische Arzneimittel, Schadstoffe, Allergene, Affektormoleküle, Wachstumsfaktoren, Chemokine, Zytokine, Lymphokine, Aminosäuren, Oligopeptide, chemische Zwischenprodukte, Nukleotide, Oligonukleotide oder dergl. umfassen. Derartige Verbindungen können beim Nachweis von Arzneimittelmissbrauch, Überwachen einer therapeutischen Dosierung, Gesundheitszustand, Spenderübereinstimmung für Transplantationszwecke, Schwangerschaft (z. B. hCG oder alpha-Fötoprotein), Krankheitsnachweis, wie zum Beispiel von Endotoxinen, Krebsantigenen, Pathogenen und dergl. verwendet werden. Therapeutische Arzneimittel können umfassen, sind jedoch nicht hierauf beschränkt: Anti-AIDS-Substanzen, Antikrebssubstanzen, Antibiotika, antivirale Substanzen, Enzyminhibitoren, Neurotoxine, Opioide, Schlafmittel, Antihistamine, Tranquilizer, Antikrampfmittel, Muskelrelaxantien und Anti-Parkinson-Substanzen, Antispasmamittel und Muskelkontraktionsmittel, Miotika und Anticholinergika, Immunsuppressiva (wie zum Beispiel Cyclosporin), Antiglaukom-Solute, Antiparasit- und/oder Antiprotozoen-Solute, Antihypertensiva, Analgetika, Antipyretika und Antientzündungsmittel (wie zum Beispiel NSAID's); Lokalanästhetika, Ophthalmika, Prostaglandine, Antidepressiva, antipsychotische Substanzen, Antiemetika, bildgebende Mittel, spezifische Anvisierungsmittel, Neurotransmitter, Proteine und Mittel zur Modifizierung der Zellreaktion. Proteine sind bei den verschiedensten Diagnostika von Interesse, wie zum Beispiel zum Nachweis von Zellpopulationen, des Bluttyps von Pathogenen, Immunreaktionen auf Pathogene, Immunkomplexe, Saccharide, Lektine, natürlich vorkommende Rezeptoren und dergl. Rezeptoren können beim Binden an Haptene, Proteine, andere Rezeptoren oder dergl. oder beim Nachweis der Anwesenheit von Pathogenen, des Spiegels eines speziellen Proteins in einem physiologischen Fluid, der Anwesenheit von Haptenen in den verschiedensten Proben, wie zum Beispiel physiologischen Fluiden, Luft, Prozessströmen, Wasser usw. Verwendung finden. Nukleinsäuren können auch beim Nachweis von Komplementärsträngen, sich speziell an Nukleinsäuren bindenden Proteinen und dergl. Anwendung finden.
Die analytischen Reaktanden können auch unter fluoreszierenden Reportermolekülen ausgewählt werden, die der Umsetzung mit den verschiedensten anorganischen Analyten fähig sind, welche Eigenschaften biologischer Fluide, Luft, Wasser und dergl. definieren, wie zum Beispiel O₂, CO₂, pH, Ca⁺⁺, Na⁺, K⁺ oder Cl^–, wie zum Beispiel in US-Patent 5,747,349 von van den Engh et al. offenbart.
Von besonderem Interesse ist die Bindung von Mikroorganismen und Zellen, einschließlich Viren, prokaryotischen und eukaryotischen Zellen, unizellularen und polyzellularen Organismenzellen, wie zum Beispiel Pilz-, Tier-, Säugetierzellen usw. oder Fragmente derselben. Üblicherweise sind diese großen Zusammenballungen nicht kovalent an die Oberfläche durch spezielle Komplexe eines Bindungspaarelements gebunden. Dadurch, dass sie eine hohe Dichte von an die Oberfläche gebundenen Bindungselementen besitzen, können eine Zelle oder ein Virus durch eine große Anzahl von Bindungspaarelementen komplexiert werden, was eine sehr starke Verankerung der Zelle, des Virus oder Fragments bereitstellt. Das System kann sodann einer heftigen Behandlung unterzogen werden, ohne dass man sich um eine Entfernung des speziell gebundenen Gebildes Sorgen machen muss, während unspezifisch gebundene Materialien leicht entfernt werden können.
Der Erfindungsgegenstand kann auch zum Nachweis von Pathogenen benutzt werden. Monoklonale Antikörper können an die Oberfläche gebunden werden, um als Einfang-Antikörper zu dienen. Die Probe wird sodann zugegeben, und Zellen, die das Epitop durch den Antikörper erkannt haben, binden sich an den Antikörper auf der Oberfläche. Unspezifisch gebundene Pathogene werden ausgewaschen, wobei im wesentlichen nur spezifisch gebundene Pathogene zurück gelassen werden. Markierte monoklonale Antikörper werden sodann zugegeben, welche für ein Epitop, das sich von dem durch den Einfang-Antikörper erkannten Epitop unterscheidet, spezifisch sind. Der Begriff Epitop ist mit dem Begriff antigene Determinante synonym und bedeutet, wie er im Vorliegenden benutzt wird, eine definierte Domäne auf dem Molekül, die als Reaktions- oder Bindungsstelle dient. Ein Molekül kann mehr als ein Epitop besitzen. Beispielsweise erlaubt ein erstes Epitop das Koppeln des Analyten mit dem jeweiligen analytischen Reaktanden, während ein zweites Epitop eine Bindungsstelle oder -domäne für das Markierungsreagens bereit stellt. Im Gegensatz dazu wird ein Kompetitormolekül die Bildung eines Bindungspaares zwischen Analyt und analytischem Reaktand stören (tritt mit diesem in Wettbewerb). Nach Inkubieren zur Ermöglichung der Umsetzung zwischen den Antikörpern und Pathogenen werden unspezifisch gebundene Antikörper ausgewaschen, und die Anwesenheit der Markierung wird gemäß Standardnachweisverfahren ermittelt. Pathogene von Interesse können Viren wie Herpesviren, Poxviren, Togaviren, Orthomyxoviren, Paramyxoviren, Rhabdoviren, Coronaviren, Arenaviren und Retroviren sein. Sie können auch Bakterien umfassen, einschließlich, jedoch nicht hierauf begrenzt, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Staphylococcus epidermidis, Serratia marcescens, Mycobacterium bovis gegen Methicillin-resistente Staphylococcus aureus und Proteus vulgaris. Die Beispiele für derartige Pathogene sind nicht auf die obigen Pathogene beschränkt, und der Fachmann weiß, welche speziellen Gattungen von Mikroorganismen und Parasiten von besonderer Bedeutung sind. Die nicht-erschöpfende Liste dieser Organismen und die zugeordneten Krankheiten können zum Beispiel in US-Patent 5,795,158 von Warinner, gefunden werden, das durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen wird.
Zum Nachweis oder der quantitativen Bestimmung eines Zielmoleküls von Interesse oder eines Analyten wird eine Probe mit einer Lösung kombiniert, die die Mikroteilchen enthält, die Makromoleküle an den Mikroteilchen werden mit dem Analyten umgesetzt, die Mikroteilchen werden von sämtlichen ungebundenen Komponenten der Probe abgetrennt, und die gebundene Moleküle enthaltenden Mikroteilchen werden durch herkömmliche Verfahren nachgewiesen. Fluoreszierend gefärbte Mikroteilchen sind besonders für die Durchflusszytometrieanalyse gemäß Verfahren geeignet, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Das Beschichten von Trägerteilchen zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren kann unter Verwendung von zum Beispiel bekannten Standardverfahren bewirkt werden. So sind representative Verfahren zum Beschichten von Teilchensystemen mit Antikörpern zur Verwendung beim Immunassay von Frengen et al. in Clin. Chem. 39 (1993), S. 2174–2181 und die hierin enthaltenen Referenzen sowie von Lindmo et al. in J. Immunol. Methods 126 (1990), S. 183–189, beschrieben.
Tests, in welchen Teilchen gemäß der Erfindung Verwendung finden, können in einem biologischen Fluid ausgeführt werden, einschließlich getrennten oder unfiltrierten biologischen Flüssigkeiten wie Urin, zerebrospinale Flüssigkeit, pleurale Flüssigkeit, synoviale Flüssigkeit, peritoneale Flüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, gastrische Flüssigkeit, Blut, Serum, Plasma, Lympfflüssigkeit, interstitiale Flüssigkeit, Gewebehomogenat, Zellextrakte, Speichel, Sputum, Stuhl, physiologische Sekrete, Tränen, Schleim, Schweiß, Milch, Sperma, Vaginalsekrete, Flüssigkeiten aus Ulcera- und anderen Oberflächeneruptionen, Blasen und Abszessen sowie Gewebeextrakten, einschließlich Biopsien normaler, maligner und verdächtiger Gewebe oder anderer Bestandteile des Körpers, welche den Analyten von Interesse enthalten können. Andere ähnliche Proben, wie zum Beispiel eine Zell- oder Gewebekultur oder Kulturbrühe, sind auch von Interesse. Die Probe wird aber auch aus einer Umgebungsquelle erhalten, wie zum Beispiel dem Boden, Wasser oder der Luft, oder aus einer industriellen Quelle, wie zum Beispiel einer Entnahme aus einem Abfallstrom, einer Wasserquelle, einer Zufuhrleitung oder einem Produktionslot. Industrielle Quellen umfassen auch Gärungsmedien, wie zum Beispiel aus einem biologischen Reaktor, oder einem Nahrungsmittelgärungsverfahren, wie dem Brauen oder Lebensmittel, wie Fleisch-, Wild-, Boden- oder Molkereiprodukte. Die Testprobe kann vor Gebrauch vorbehandelt werden, wie zum Beispiel durch Herstellung von Plasma aus Blut, Verdünnen viskoser Flüssigkeiten oder dergl.; Behandlungsverfahren können die Filtration, Destillation, Konzentration, Inaktivierung störender Verbindungen und die Zugabe von Reagentien umfassen.
Ein Verfahren zum Nachweis von Mehrfachunterpopulationen von Analyten des Interesses in einer Probe unter Verwendung eines komplementären Bindungsrests für jeden der an einen festen Träger gebundenen Analyten, wobei jeder Analyt und sein komplementärer Bindungsrest ein erstes bzw. zweites Element eines spezifischen Bindungspaares umfasst, wird bereit gestellt. Das Verfahren umfasst die Stufen der Bildung eines Gemischs bekannter Anteile von Mehrfachunterpopulationen der komplementären Bindungsreste, wobei jede Unterpopulation verschiedene komplementäre Bindungsreste umfasst, das In-Berührung-Bringen der Probe mit dem Gemisch, so dass spezifische Bindungspaare an den festen Trägern gebildet werden, und das In-Verbindung-Bringen der Anwesenheit von Analyten von Interesse in der Probe (US-Patent 5,567,627 von Lehnen).
Für die Zwecke vorliegender Erfindung sollte die Markierung oder das nachweisbare Fluoreszenzreagens ein auf die Anwesenheit von Analyt in der Probe bezogenes Signal zur Verfügung stellen, das zum Nachweis elektromagnetischer Strahlung, insbesondere Licht im Ultraviolett-, sichtbaren oder Infrarotbereich führt.
Tests können in Übereinstimmung mit den verschiedenen Protokollen durchgeführt werden. Gemäß vorliegender Erfindung wird die Probe mit dem vorliegenden festen Substrat in Berührung gebracht, und verschiedene Arbeitsgänge können durchgeführt werden, wie zum Beispiel die Zugabe von verschiedenartigen Reagentien, Inkubierungen, Waschungen und dergl. Das Endergebnis der Versuche wird die Veränderung der Menge eines Produkts sein, welches Licht absorbiert oder erzeugt, entweder durch Lichtabsorption oder durch Lichtemission im Verhältnis zur Anwesenheit oder Menge des Analyten von Interesse. Üblicherweise ist dies wie ein Ergebnis der Bildung eines speziellen Bindungskomplexes zwischen den komplementären Elementen eines speziellen Bindungspaares, wo eines der Elemente als eine Brücke zur Bildung eines Sandwichs (wie im „Sandwich"-Test) dienen kann, oder es kann ein einziger Komplex sein oder Komplexe können an Komplexbindungsproteine gebunden sein, wie zum Beispiel S. aureus-Protein A, ein rheumatoider Faktor, für Immunkomplexe spezifische Immunoglobuline oder dergl.
Dadurch, dass die Probe fluoreszierende Markierungen, wie zum Beispiel fluoreszierende Teilchen, fluoreszierende konjugierte Antikörper oder dergl., aufweist, kann sie mit Licht bestrahlt werden, das durch die Fluoreszierungsmittel absorbiert wird und das emittierte Licht kann durch Lichtmessvorrichtungen gemessen werden.
Farbstoffe können als Markierung verwendet oder als Ergebnis einer Umsetzung, wie z. B. einer enzymatisch-katalysierten Umsetzung, gebildet werden.
In ähnlicher Weise kann man mit Nukleinsäuretests, welche eine Hybridisierung umfassen, die erforderlichen Stufen durchführen, um nachzuweisen, ob komplementäre Sequenzen vorliegen und unter Anwendung der verschiedensten Protokolle eine farbige oder fluoreszierende Markierung oder ein Produkt der Markierung bereitstellen, das die Anwesenheit oder Abwesenheit der komplementären Sequenz anzeigt.
Beispielsweise könnte man die Oberfläche unmittelbar vor der Durchführung des Tests durch Diazotieren der Aminofunktionalitäten aktivieren, die Nukleinsäureprobe zur aktivierten Oberfläche zugeben, so dass sie kovalent gebunden wird, und sodann Sonden mit einer zur Sequenz von Interesse komplementären Sequenz benutzen, die z. B. mit einer Biotinmarkierung funktionalisiert sind. Nach Abschluss der Hybridisierungsstufe könnte man ein Enzym oder ein an Avidin konjugiertes Fluorochrom zugeben, welches sich an ein an die Oberfläche durch Hybridisierung gebundenes Biotin bindet. Nach Auswaschen nicht spezifisch gebundenen Avidins kann das Fluorochrom direkt gemessen werden, oder das Substrat für das Enzym kann zugegeben werden, und die Bildung des Produkts zeigt die Anwesenheit und Menge der komplementären Sequenz an.
Eine Variation ist die Verwendung eines durch einen Zellrezeptor erkannten Antigens. Das Antigen wird an die Oberfläche gebunden, um die Zellen abzufangen, und es wird ein markiertes Antigen zur Markierung der Zellen verwendet. Der Rezeptor kann Immunoglobulin an der Oberfläche sein. Auf diesem Weg kann die Anwesenheit spezifisch gebundener Zellen bestimmt werden, wobei das Antigen von Interesse komplementär an den an der Oberfläche gebundenen Rezeptor gebunden wird, und Zellen mit dem für ein derartiges Antigen spezifischen Immunoglobulin kann bestimmt werden. Anstelle von Antigen können Antikörper zu dem Antigen an die Oberfläche gebunden sein, um das Antigen nicht-kovalent an die Oberfläche zu binden.
Vorliegender Artikel kann auch bei der Isolierung verschiedener Produkte von Interesse Anwendung finden, wie z. B. von Blutplasmaproteinen, Wachstumsfaktoren, Gerinnselfaktoren, Antigerinnselfaktoren und dergl., welche sodann aus dem Komplex durch verschiedene Salzlösungen freigesetzt werden können. Der erfindungsgemäße Artikel kann für die verschiedensten anderen Zwecke verwendet werden, wann immer man die Bereitstellung einer hohen Dichte von ausgerichteten Molekülen an einer Oberfläche oder Ereignisse sichtbar machen, oder eine schnelle Lichtübertragung bereitzustellen wünscht, wo die Analytensubstanz an eine feste Fläche nicht-diffusiv gebunden ist.
BEISPIEL 1
Allgemeiner Überblick über das fluoreszierende Färben von Teilchen.
Ein 1-%-iger Vorrat von Nanokugeln (300 nm Polystyrol, aminofunktionalisiert) in einem wässrigen Medium wird in einen Rundkolben pipettiert. Sodann wird eine Farblösung (aus einem oder mehreren Farbstoffen zusammengesetzt) in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, zugegeben. Man lässt die Suspension sich absetzen, bis die Farbstofflösung nicht mehr von Nanokugeln absorbiert wird. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck (Vakuumpumpe) entfernt. Ein wässriges Medium wird zu den gefärbten Nanokugeln zugegeben, beschallt und in einen Vorratsbehälter übergeführt.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden eine oder mehrere Gruppen von Nanoteilchen hergestellt und jede Gruppe mit einem unterschiedlichen Farbstoff bei einer zuvor festgelegten Konzentration gefärbt. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Trägermikrokugeln selbst mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt.
Die Gruppen der monochromen Nanoteilchen werden sodann in einem gewünschten Verhältnis vermischt und weiter verwendet, um sie an einem Präparat von Trägermikrokugeln anzubringen oder zu konjugieren. Diese Konstruktion ist der Gegenstand der Erfindung. Die erhaltenen fluoreszierenden Artikel werden sodann getestet, um die Fluoreszenzaktivität/Dichte des Präparats zu bestimmen. Jede Gruppe oder Population von Nanoteilchen-Mikroteilchen-Konjugaten zeigt ein optisches Muster oder Fluoreszenzsignal (eine „optische Signatur"), die für die spezielle Gruppe oder Population der Artikel einmalig ist. Eine andere Population von Artikeln kann z. B. die gleiche Gesamtanzahl fluoreszierender Nanoteilchen besitzen, jedoch sind sie in einem verschiedenen Verhältnis vermischt. Da man lediglich zwei Farbstoffe hat, kann man eine hohe Anzahl von Gruppen des Gegenstands mit einmaligem Fluoreszenzsignal herstellen, dadurch, dass man das Präparat der Mikroteilchen mit einem noch anderen Farbstoff färbt, erhält man sogar eine höhere Anzahl von mehrfach gefärbten Artikeln. Dies ist eine wesentliche Verbesserung über den Stand der Technik. Die vorliegenden Erfinder waren erstmals fähig, die Erfindung auf die Praxis zurückzuführen.
BEISPIEL 2
Gleichzeitiges Färben mit zwei Farbstoffen
Es wird eine einzige Lösung mit einem Gehalt an zwei unterschiedlichen Farbstoffen hergestellt und zum Färben des gleichen Teilchens verwendet. Ein Farbstoff ist ein roter fluoreszierender Farbstoff, nämlich das Bis(innere Salz) von 1,3-Bis[[1,3-dihydro-1,3,3-trimethyl-2H-indol-2-yliden)methyl]-2,4-dihydroxy-cyclobutendiylium, und ein zweiter Farbstoff ist ein fluoreszierender oranger Farbstoff, der 2-(3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)-4-(3,5-dimethyl-2H-pyrrol-2-yliden)-3-hydroxy-2-cyclobuten-1-on sein kann. Die Spitzenemission des Farbstoffs #1 ist 585 nm, und die Spitzenemission des Farbstoffs #2 ist 630 nm. Diese Farbstoffe werden ausgewählt, weil sie in den Mittelpunkt von zwei Fluoreszenzkanälen eines Becton-Dickinson FACScan Abtastdurchströmungszytometers fallen, der das benutzte Messinstrument ist. Die Auswahl von Fluoreszenzkanälen ist jedoch relativ und unerheblich, da eine andere Durchströmungszytometrievorrichtung unterschiedliche Einstellungen haben kann.
Dadurch, dass die Herstellung von Mikroteilchen oder Nanoteilchen, die mit zwei, in verschiedenen Verhältnissen gemischten Farbstoffen, vorgenommen wird, erhält man sogar eine höhere Anzahl von mehrfach gefärbten Artikeln als diejenige, die im Beispiel 1 offenbart ist.
BEISPIEL 3
Herstellung von Mehrfachgruppen oder -populationen unterschiedlicher Teilchenpopulationen.
Während theoretisch Vermutungen angestellt wurden, dass derartige Gruppen für eine Multiplexanalyse (vgl. z. B. McHugh, „Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitive and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes" in Methods in Cell Biology, 42, Teil B, (Academic Press, 1994) extrem wertvoll sein können, gibt es bislang keine bekannten Beispiele, welche die Zurückführung auf die Praxis von greifbaren, mehrfach gefärbten Perlen ermöglicht und belegt. Bestenfalls konnte lediglich eine und vielleicht maximal 5 Populationen von Perlen, die verschiedene Verhältnisse zweier Farbstoffe enthielten, möglich gemacht werden. Beispielsweise offenbart das US-Patent 4,717,655 solche Perlen; jedoch wurde keine Offenbarung ermöglicht, und der Gegenstand der Zusammensetzung sowie das Verfahren zur Herstellung derartiger Perlen ist ohne Beziehung zu vorliegender Erfindung. Im Gegenteil, infolge vorliegender Erfindung ist es nunmehr technisch möglich, wirklich verschiedenartige mehrfache Untergruppen zu erhalten.
Zur Herstellung einer anderen Population von Perlen mit unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften wird das Verhältnis von Nanoteilchenpopulationen mit roten orangen Farbstoffen durch einen ausreichenden Zuwachs des Anteils verändert, so dass das erhaltene Verhältnis sich optisch nicht mit dem ersteren Verhältnis überlappt. Vorliegende Erfindung stellt eine sehr große Anzahl von Gruppen optisch unterschiedlicher Trägerperlen zur Verfügung, indem man das Verhältnis von gerade zwei Populationen von Nanoteilchen, die mit zwei verschiedenartigen Farben gefärbt sind, variiert. Dieses Beispiel ist keineswegs ein begrenzendes Beispiel, da der Fachmann leicht eine geringere oder höhere Anzahl von Perlenuntergruppen unter Anwendung vorliegender Lehre herstellen kann. Man kann auch nur eine Population von Nanoperlen verwenden und das Verhältnis zum Trägerteilchen, dass auch gefärbt ist, verändern. Ein Fachmann kann sich dessen bewusst sein, dass nichts, das dieser Errungenschaft auch nur nahe kommt, in der gegenwärtigen Praxis jemals möglich war. Der Stand der Technik lehrte den Durchschnittsfachmann nicht, wie er dies erreicht.
BEISPIEL 4
Koppeln eines Fluoreszenzfarbstoffs an einen Antikörper
Der Fluoreszenzfarbstoff 5(6)-Carboxyfluorescein wird mit dem Antikörper unter Verwendung von 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester verbunden. Zur Herstellung des Esters werden N-Hydroxysuccinimid (2,1 mM) und Dicyclohexylcarbodiimid (2,1 mM) zu 5(6)-Carboxyfluorescein (2,0 mM), aufgelöst in Tetrahydrofuran, zugegeben. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird in der Kälte bei 4°C 3 Tage stehengelassen, um die Bildung des Esters zu ermöglichen. Der 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester wird sodann mit gereinigtem primären Antikörper IgG (10 mg), aufgelöst in 0,1 M NaHCO₃ (3 ml; pH-Wert 8,6), mit einem Gehalt an 0,1 M NaCl umgesetzt. Der erhaltene, mit Fluorescein markierte primäre Antikörper wird sodann nach bekannten Verfahren, wie z. B. durch Gelfiltration, gereinigt.
BEISPIEL 5
Koppeln eines analytischen Reaktanden an Mikroteilchen und/oder Nanoteilchen
Eine Reihe von Antikörpern, Antigenen oder Nukleinsäuresonden, im Folgenden pauschal als analytische Reaktanden bezeichnet, werden an die Perlen nach irgend einem einer Anzahl herkömmlicher Verfahren gebunden, wie beschrieben von Colvin u. a., „The Covalent Binding of Enzymes and Immunoglobulins to Hydrophilic Microspheres" (das kovalente Binden von Enzymen und Immunoglobulinen an hydrophile Mikrokugeln) in Microspheres: Medical und Biological Applications, 1–13, CRC, Boca Raton, FL, 1988; Cantarero u. a., „The Adsorptive Characteristics of Proteins for Polystyrene and Their Significance in Solid-Phase Immunoassays", (die Adsorptionseigenschaften von Proteinen für Polystyrol und ihre Bedeutung in Festphasen-Immunassays Anal. Biochem., 105, 375–382 (1980)); und Illum u. a. „Attachment of Monoclonal Antibodies to Microspheres" , (Befestigen von monoklonalen Antikörpern an Mikrokugeln) Methods in Enzymol., 112, 67–84 (1985).
In diesem Beispiel wird ein Kaninchenantikörper, hervorgerufen gegen einen Analyten, an die Mikroteilchen gekoppelt. Der Antikörper wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vom pH-Wert 8 dialysiert, was zu einer Konzentration von etwa 3 mg/ml führt, bestimmt durch Absorption bei 280 nm. 6 mg des Antikörpers wird mit SPDP [3-(2-Pyridyldithiopropionsäure-N-hydroxysuccinimidester der Fa. Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) 30 Minuten unter Verwendung einer Lösung von 1,5 mg SPDP in 1,5 ml Methanol derivatisiert. Sodann wird 1 M Natriumacetat vom pH-Wert 4,5 zugegeben, gefolgt von 1 M Dithiothreit (DTT). Die Lösung wird bei Raumtemperatur weitere 30 Minuten gerührt und sodann auf eine SEPHADEX G-25-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) aufgebracht, um freien DTT zu entfernen und den derivatisierten Antikörper in einen Kopplungspuffer vom pH-Wert 8 zu bringen (50 mMol Tris Base, 50 mMol Natriumacetat, 50 mMol Natriumchlorid und 1 mMol EDTA). Das Antikörperpräparat wird mit den Mikroteilchen vermischt, welche mit Tris unmittelbar vor Verwendung auf den pH-Wert 8 gebracht werden, in einem Verhältnis von 1 mg Antikörper pro 100 nM Maleimid. Das Gemisch wird 2 Stunden inkubiert. Die funktionalisierten Teilchen werden sodann von freiem Antikörper auf einer SEPHAROSE-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.), die in 30 mM MOPSO, 10 mM EDTA, 100 mM Glucose und 0,2% Natriumazid, pH-Wert 6,8, ins Gleichgewicht gebracht wird. Es wird Miles Pentex Fraction V BSA zugegeben, um eine Endkonzentration (Gewicht/Volumen) von 1% zu ergeben. Andere Proteine und aminhaltige Verbindungen, wie z. B. Enzyme, Avidin, Biotin oder Polysaccharide können kovalent an verschiedene Teilchen unter Anwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens oder ähnlicher Standardverfahren, die gut bekannt sind, gebunden werden.
Nach Anbringen eines Reaktanden an die Oberfläche der Perlen werden gleiche Teile von jeder Untergruppe vermischt, um ein Pool zu bilden, der bekannte Mengen von Perlen innerhalb jeder Untergruppe enthält. Vorzugsweise wird die zusammengefasste Gruppe mit gleichen Volumina von Perlen aus jeder Untergruppe hergestellt, so dass die Gruppe etwa die gleiche Anzahl von Perlen aus jeder Untergruppe oder Population enthält. Dieser Pool wird sodann mit einer flüssigen Probe von Interesse inkubiert, wie z. B. mit Serum oder Plasma, um auf die Anwesenheit von Antigenen (Analyten) in der Flüssigkeit zu testen, die mit Antikörpern auf den Perlen reaktionsfähig sind. Eine derartige Inkubation wird in der Regel unter Bedingungen der Temperatur, des pH-Wertes, der Ionenkonzentrationen und dergl. durchgeführt, was eine spezifische Reaktion eines analytischen Reaktanden in der Flüssigkeitsprobe mit dem Analyten auf der Perloberfläche erleichtert. Nach einem ausreichenden Zeitraum werden die Perlen im Gemisch während eines anderen Zeitraums mit einem „Markierungsreagenz", wie z. B. einem mit Fluorescein markierten Ziegenantikörper inkubiert, der den Analyten von Interesse über ein Epitop (Antikörper-bindendes Fragment des Analyten) bindet, der sich von dem Bindungsepitop des Kaninchenantikörpers unterscheidet. Der zweite Antikörper oder das zweite Markierungsreagenz bindet sich an den Analyten von Interesse, der an die Perlen über einen einfangenden Kaninchenantikörper gebunden ist. Nach dem Waschen (oder ohne Waschen) werden die Perlen mit einem Durchflusszytometer behandelt, und die vier Klassifizierungsparameter Vorwärtslichtstreuung, Seitenlichtstreuung, rote Fluoreszenz und orange Fluoreszenz werden gemessen und zur Identifizierung der Untergruppe oder Population verwendet, zu der jede Perle gehört. Ein gleichzeitiges Messen der grünen Fluoreszenz (Messungsparameter, der dem Markierungsreagenz zugeordnet ist) für jede Perle ermöglicht zu bestimmen, ob an der Perle ein Antikörper gebunden ist. Weil die Untergruppe, zu der eine Perle gehört, in Wechselbeziehung mit der Anwesenheit eines speziellen Antigens, beispielsweise einer Reihe von Grasallergenen verschiedene Missbrauch-Arzneimittel, eine Gruppe von Pathogenen, kann man die Spezifizität des an eine Perle gebundenen Antikörpers leicht als Funktion der Untergruppe, zu der er gehört, bestimmen.
Grasallergene können Ambrosiapflanzen- und gemischte Graspollenextrakte (Timotheus-, Obstgarten-, Juni- und Heuwiesengras) umfassen. Beispiele für diese Grasallergene, die zur Eichung und zu Vergleichsstudien als Bezugsmaterial dienen können, können von Greer Laboratories (Lenoir, N. C., USA) bezogen werden. Spezielle Beispiele für Missbrauch-Arzneimittel und kontrollierte Substanzen können umfassen, sollen jedoch nicht hierauf beschränkt werden: Amphetamin, Ethamphetamin, Barbiturate wie Amobarbital, Secobarbital, Pentobarbital, Phenobarbital und Barbital; Benzodiazepine wie Librium und Valium; Cannabisabkömmlinge wie Haschisch und Marihuana; Kokain; Fentanyl, LSD; Methapulaon; Opiate wie Heroin, Morphin, Codein, Hydromorphon, Hydrocodon, Methadon, Oxycodon, Oxymorphon und Opium; Phencyclidin; Propoxyhen und dergl. Diese Substanzen können als Analyten von Interesse sowie als Bezugsmaterial dienen.
BEISPIEL 6
Carbodiimid-Befestigung
Dieses Beispiel offenbart ein Verfahren zum Befestigen eines Analyten, wie z. B. eines Antikörpers, an einem Teilchen unter Verwendung der bekannten Carbodiimid-Chemie. Es wird darauf hingewiesen, dass diese gleiche Methode nicht nur zur Befestigung eines speziellen Analyten sondern auch zum Befestigen von Nanoteilchen an dem Träger-Mikroteilchen angewandt wird.
Ein monoklonaler Antikörper wird kovalent an Polymerteilchen mit Carboxylgruppen an den Außenflächen gebunden. Die Teilchen setzen sich aus Polystyrol-co-methacrylsäure) (im Molverhältnis von 90 : 10) zusammen. Eine Probe der Polymerteilchen (mit einem Trockengewicht von 30 mg) wird mit dem Carbodiimid vermischt, gefolgt von der Zugabe von 1,5 mg Antikörper. Die Bindungsreaktionen werden durch Inkubation des Gemischs während 24 Stunden unter Umdrehung bei Raumtemperatur durchgeführt. Durch Zugabe von Rinderserumalbumin (30 mg/ml) wird die Umsetzung abgebrochen, wonach die Inkubation weitere 4 Stunden fortgesetzt wird. Die Reaktionsgemische werden zentrifugiert, der Überstand wird verworfen, und die Pellets werden einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4) gewaschen und sodann in der Kochsalzlösung wieder suspendiert. Die Masse des an jedes Latexpräparat gebundenen Antikörpers wird durch Testen der Anzahl radioaktiver Zählungen für parallel laufende Proben mit an die Teilchen gebundenem mit Tritium markierten Gammaglobulin bestimmt. Das kovalente/gesamte Verhältnis wird nach Inkubation mit Natriumdodecylsulfat als oberflächenaktives Mittel berechnet. Die weiteren Einzelheiten hinsichtlich dieses Verfahrens können z. B im US-Patent 5,397,695 von Sutton et al., gefunden werden.
Die Nanoteilchen werden auf im Wesentlichen ähnliche Art und Weise wie zuvor kovalent an die Träger-Mikroteilchen gebunden. Die erhaltenen gekoppelten Teilchen können weiter mit einer polymeren Schale beschichtet werden, die z. B. durch Vermischen der Teilchen in monomerem Styrol (0%–80%) und Divinylbenzol (20%– 100%) während einer Zeit gebildet werden, die ausreicht, um die Teilchen zu beschichten und sodann die Beschichtung durch Zugabe von Kaliumpersulfat zu polymerisieren. Ein anderer Weg, die Schale zu erhalten, ist, durch ein mehrwertiges Molekül die funktionellen Gruppen an der Oberfläche zusammen zu vernetzen. Beispielsweise deckt 1,1,1-Tris(aminoethyl)propionitril mindestens drei Carbonsäurereste auf der Oberfläche der Teilchen ab. Die Oberfläche der Schale wird weiter modifiziert, um jeweilige funktionelle Gruppen durch Oxidation der Nitrilgruppe zu einer Carbonsäure oder Reduktion derselben zu einer Aminogruppe bereitzustellen.
BEISPIEL 7
Herstellung von Albumin-Mikroteilchen, markiert mit FITC
Es können Träger-Mikroteilchen aus irgend einem Polymermaterial einschließlich eines proteinartigen Materials hergestellt werden. Dieses Beispiel beschreibt das Verfahren des Fluoreszenzfärbens eines derartigen Trägerteilchens. Fluoresceinisothiocyanat (FITC, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., USA) wird in Gegenwart von Polymeren, welche die Bildung von Konjugatteilchen verursachen, an menschliches Serumalbumin (HSA) konjugiert. Freies FITC wird von den Teilchen abgewaschen, und die Teilchen werden in NaOH wieder gelöst, wobei mit FITC markiertes HSA in Abwesenheit von freiem FITC erhalten wird.
FITC (6,2 μg) wird in 2 ml Carbonatpuffer (pH-Wert 10) gelöst. Das gelöste FITC wird mit 1 ml HSA (25%) und 6 ml einer Polymerlösung mit einem Gehalt an 25% PVP vereint, und es werden 25% PEG in 0,1 M Natriumacetat vom pH-Wert 5,0 unter Aufwirbeln zugegeben. Das Gemisch wird jeweils 30 Minuten nacheinander bei Raumtemperatur, 37°C und 58°C inkubiert. Die Konjugatteilchen fallen als Ergebnis an. Das Gemisch wird in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 UpM zentrifugiert, der Überstand wird entfernt, und die Teilchen werden dreimal mit entionisiertem Wasser (jeweils 10 ml) gewaschen. Die Teilchen werden in 10 ml entionisiertem Wasser wieder suspendiert. Die wieder suspendierten Teilchen werden in einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Sämtliche Fluoreszenz ist den Teilchen zuzuschreiben. Es wird keine freie Fluoreszenz beobachtet, was zeigt, dass sämtliches FITC an Albumin konjugiert ist, und dass keine freien FITC-Moleküle vorliegen.
BEISPIEL 8
Bildung von Mikroteilchen mit befestigter Oligonukleotid-Sonde
In einer ersten Stufe wird eine geeignete Sonde zum Nachweis einer DNA-Sequenz von Interesse ausgewählt. Eine derartige Sonde wird nach bekannten Verfahren (wie z. B. durch Carbodiimid-Koppeln, vgl. oben, oder ein anderes Mittel) an Teilchen gekoppelt, um einzelne gleiche Teile von Perlen, an die bekannte Oligonukleotide gekoppelt sind, herzustellen. Die Oligonukleotide müssen lang genug sein, um eine spezifische Hybridisierung beim Test zu ermöglichen, z. B. in der Regel zwischen etwa 5 und 500 Nukleotiden, vorzugsweise zwischen etwa 10 und 50 Nukleotiden, bevorzugter zwischen etwa 20 und 30 Nukleotiden, in der Länge. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine sättigende Menge des Oligonukleotids an die Perle gebunden. Fluoreszierende Oligonukleotide, werden komplementär zu sämtlichen an jede Perle gebundenen Sequenzen oder zu einem Teil derselben, auch hergestellt. Sodann werden PCR-Primer ausgewählt, die zur Verstärkung des speziellen Bereichs der DNA in der Probe verwendet werden, welche die dem an die Perlen gekoppelten Oligonukleotid entsprechende Sequenz, enthält. Es können eine doppelsträngige (ds) oder einfachsträngige (ss) PCR-Verfahren angewandt werden. Wenn ein doppelsträngiges Produkt (dsDNA) hergestellt wird, wird das verstärkte PCR-Produkt einsträngig gemacht, indem man es auf eine Temperatur und während eines Zeitraums erwärmt, die ausreichend sind, um gemäß gut bekannten Verfahren die dsDNA zu denaturieren. Das Gemisch wird abgekühlt, und die Perlen werden zugegeben und mit dem PCR-Produkt unter Bedingungen inkubiert, die geeignet sind, die Hybridisierung zwischen dem Oligonukleotid an den Teilchen und dem PCR-Produkt auftreten zu lassen (z. B. bei Raumtemperatur während 10, Minuten). Die Hybridisierungszeit kann je nach den gewünschten Ergebnissen schwanken und z. B. 24 Stunden lang oder länger anhalten. Die fluoreszierende DNA-Sonde wird sodann zugegeben, und das gesamte Gemisch wird unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert, die für das Ermöglichen einer kompetitiven Hybridisierung geeignet sind. Der Fachmann ist sich dessen bewusst, dass die Konzentrationen des PCR-Produkts und der zu verwendenden fluoreszierenden Sonde schwanken und zur Optimierung der Umsetzung eingestellt werden können. Es ist auch anerkannt, dass die Reihenfolge des Vermischens der Sonde, der Zielverbindung und des Konkurrenten-Moleküls schwanken kann, und nicht notwendigerweise, wie im Vorliegenden beschrieben, die gleichen sind.
In der Regel sind die zu verwendenden Konzentrationen des PCR-Produkts und der fluoreszierenden Sonde so eingestellt, um den nachweisbaren Verlust der Fluoreszenz zu optimieren, welcher sich aus der kompetitiven Hemmung ergibt, und dies nicht auf Kosten der Fähigkeit des Tests, zwischen einer vollkommenen Komplemtärität und einer oder mehreren fehlerhaften Nukleotid-Paarungen zu unterscheiden. Man kann absichtlich fehlerhafte Paarungen schaffen, wie bei Tests mit einer entarteten Sonde. Bei einem beispielhaften Test ist die Konzentration des PCR-Produkts komplementär zu dem an die Perlen gebundenen Oligonukleotid in der Größenordnung des ein- bis zehnfachen der Konzentration der verwendeten fluoreszierenden Sonde. Wenn das PCR-Produkt viel länger als das an die Perle gebundene Oligonukleotid ist, ist die Menge des PCR-Produkts dementsprechend erhöht, um die relativen molaren Konzentrationen im Bereich der DNA, komplementär zum an die Perle gebundenen Oligonukleotid, wiederzuspiegeln. Die fluoreszierende Sonde wird vorzugsweise in einer Menge zugegeben, die zur Sättigung des komplementären Oligonukleotids an den Perlen ausreicht, wie z. B. im Bereich des 1 bis 1.000fachen und mehr, vorzugsweise 2fachen bis 100fachen oder mehr, insbesondere bevorzugt des etwa 20–50fachen, der Konzentration des an die Perle gebundenen Oligonukleotids.
Die fluoreszierende Oligonukleotidsonde kann nach bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z. B. dem im U.S.-Patent Nr. 5.403.711 beschriebenen, welches durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen wird, oder durch andere gut bekannte Mittel.
BEISPIEL 9
Verdrängungs- oder Konkurrenztest unter Verwendung eines Konkurrenten-Moleküls
Tests für viele Substanzen in einem klinischen Labor liegt die gegenseitige Beeinflussung mit spezifischem Ligand-Ligat- oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen zugrunde. In diesen Tests werden ein Element des Liganden-Ligatpaars mit dem Fluorophor oder Fluorochrom markiert, und ein Element wird an den Perlen immobilisiert. Das Reaktionsgemisch wird mit einem löslichen, unmarkierten Analyten versetzt, der Ligand oder Ligat sein kann, um die Wechselwirkung der markierten Komponenten mit der immobilisierten Komponente kompetitiv zu hemmen. Üblicherweise ist es nicht wichtig, welches Element des Paars markiert und welches immobilisiert ist; bei bestimmten Tests können jedoch bestimmte funktionelle Vorteile die Ausrichtung des Tests oder der Reihenfolge, nach der die Bestandteile zugemischt werden, bestimmen.
Bei einem beispielhaften Test dieser Art wird jede Perlenuntergruppe mit einem Antigen versehen. Die antigenbeschichteten Perlen werden sodann mit dem markierten Antikörper umgesetzt, der für das Antigen auf der Perlenoberfläche spezifisch ist. Die nachfolgende Zugabe einer Testflüssigkeit mit einem Gehalt an löslichem Analyten (Inhibitor) verdrängt den markierten Antikörper von den Perlen direkt proportional zur Konzentration des löslichen Analyten. Eine Standardkurve bekannter Analytenkonzentrationen wird benutzt, um eine genaue Quantifizierung des Analyten in der Testprobe bereitzustellen. Aus Gründen der Klarheit wird auf einen Analyten bekannter Konzentration, der zum Aufbau einer Standardkurve verwendet wird, als Bezugsmaterial Bezug genommen. Das Bezugsmaterial ist üblicherweise und im Wesentlichen identisch mit dem Analyten oder einem Teil des Analytenmoleküls. Wenn das PCR-Produkt dem Oligonukleotid auf der Perle vollkommen komplementär ist, hybridisiert es kompetativ zu ihm mit einem höheren Grad der Bindungsaffinität als beobachtet wird, wenn das PCR-Produkt nicht vollkommen komplementär ist. Somit setzt das PCR-Produkt die Bindung des fluoreszierenden komplementären Oligonukleotids an die Perle mehr oder weniger wirksam herab, je nach dem Grad der Komplemtärität des PCR-Produkts.
BEISPIEL 10
Nukleinsäureanalyse
Die für diesen Test verwendete Nukleinsäure ist entweder eine natürlich vorkommende Nukleinsäure, wie sie z. B. in einer unmodifizierten Probe wie einer Blutzelle oder einem Pathogen gefunden wird, oder kann sie alternativ eine verstärkte Nukleinsäure sein, wie sie aus dem Klonen eines Plasmids resultiert oder als Ergebnis einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erhalten wird.
Die Kraft und Empfindlichkeit der PCR fanden ihre Anwendung auf die verschiedensten analytischen Probleme, bei denen der Nachweis von DNA- oder RNA-Oligonukleotidsequenzen erforderlich ist. Eine Hauptschwierigkeit bei dem PCR-Verfahren ist die beschwerliche Natur der Mess- und Analysierverfahren des Endprodukts, d. h., der verstärkten DNA. Ein durchfluss-zytometrischer Hybridisierungstest auf Perlenbasis erlaubt den extrem schnellen und genauen Nachweis genetischer Sequenzen von Interesse. Bei einer bevorzugten Ausführungsform vorliegender Erfindung wird eine Perle bereitgestellt, an die ein Nukleinsäuresegment von Interesse gekoppelt wurde. Ein PCR-Produkt von Interesse (oder irgend ein anderes DNA- oder cDNA-Segment, nicht notwendigerweise durch ein PCR-Verfahren erhalten), wird dank seiner Fähigkeit nachgewiesen, die Hybridisierung zwischen dem Nukleinsäuresegment auf der Perle und einer komplementären fluoreszierenden DNA-Sonde kompetitiv zu hemmen. Das Verfahren ist empfindlich und genau; es ermöglicht den Nachweis einzelner Punktmutationen in dem PCR-Produkt oder der DNA von Interesse. Die Multiplex-DNA-Analysenmethode kann angewandt werden, um irgend ein PCR-Produkt oder eine andere DNA von Interesse für spezifische Polymorphismen oder Mutationen nachzuweisen, und der Fachmann ist sich dessen bewusst, dass zahlreiche Anwendungen vorstellbar sind, wie z. B. die Anwesenheit von Gewebeverträglichkeitsallelen, die mit Empfindlichkeit für Erkrankungen verbunden sind, mit genetischen Erkrankungen verbundene Mutationen, Autoimmunerkrankungen oder Mutationen von Onkogenen oder Genen, die mit einer Neoplasie oder einem Neoplasierisiko verbunden sind. Verschiedene, mit den zuvor genannten Zuständen verbundenen Gene sind nunmehr bekannt, einschließlich, jedoch nicht beschränkt hierauf, eines zystischen Fibrosegens, einer multiplen endokrinen Neoplasie vom Typ 2a (MEN2a), einer multiplen endokrinen Neoplasie vom Typ 2b (MEN2b), einer multiplen endokrinen Neoplasie vom Typ 1 (MEN 1), eines Retprotoonkogens, eines low density Lipoprotein- (LDL-)rezeptors, einer Neurofibromatose vom Typ 1 (NF1), einer Neurofibromatose vom Typ 2 (NF2), einer Brust- und Ovarkrebsempfindlichkeit vom Typ 1 (BRCA1), einer Brust- und Ovarkrebsempfindlichkeit vom Typ 2 (BRCA2), einer Brust- und Ovarkrebsempfindlichkeit vom Typ 3 (BRCA3), einer adenomatösen Polyposis coli (APC), einer Adenosindeaminase, eines Xeroderma pigmentosum Gruppe A korrigierenden Gens (XPAC), einer excision repair crosscomplementing rodent repair deficiency complementation group 6 (ERCC6), eines fragilen X-mentalen Verzögerungsproteins 1 (fmr1), des Muskeldystrophie-Duchenne-Gens, einer myotonen Dystrophie-Proteinkinase, eines Androgenrezeptors, ein mit der Huntington's Erkrankung verbundenes Gen, einer Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribotransferase (HPRT), eines Apolipoproteins E, einer beta-Hexosaminidase-alpha-Kette (HEXA), einer Steroid-21-hydroxylase, eines Angiotensins, einer menschlichen nodulären, gemischten lymphozytischen und histiozytischen Zellen-Fehlanpassungsreparatur (hNMLH1 und 2), einer Retinoplastomie-Empfindlichkeit (Rb), eines transformationsverbundenen Proteins 53 (p53), RAS, Brechpunkt-Clusterbereich/Tyrosin-Proteinkinase (bcr/abl), B-Zellenleukämie/Lymphomie 2 (bcl-2), Genen, die Ionentransporter codieren sowie deren Kombinationen. Diese Gene können oder können nicht mit Erkrankungen und klinischen Störungen verbunden sein, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: menschlicher Myotonie, Paramytonia congenita, hyperkalämische periodische Paralyse, hypertrophe Kardiomyopathie, erbliche ovalozytische rote Blutzellen, erbliche Spherozytose, Glucose/Galactose-Malabsorption, familiäre Hypercholesterinämie, Hirnsklerose, schwere kombinierte Immunodefizienz, Autoimmunkrankheit, insulinabhängigem Diabetes mellitus, Cockayne's-Syndrom, spinaler und bulbärer Muskelatrophie, Peutz-Jegher's-Syndrom, Lesh-Nyhan-Syndrom, Tay-Sachs- und Alzheimer-Krankheit, kongenitaler adrenaler Hyperplasie und Hypertension, essentieller Hypertension, erblichen Nichtpolypose-Dickdarmkrebs, erblichen Dickdarmkrebs, familiären Retinablastoms, Li-Fraumeni-Syndroms, chronischer myelogener Leukämie, follikulären und diffusen Lymphoms, malignem Lymphoms, Leukämie, Hautkrebs, Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs sowie deren Kombinationen.
Zusätzlich zu den vorherigen Malignitäten, können andere Krebsarten umfassen: Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenes Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endothelsarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendotheliosarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewings's-Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Rhabdosarkom, Colorectalcarcinom, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Plattenepitelcarconom, Basalzellencarcinom, Adenocarcinom, Schweißdrüsencarcinom, Talkdrüsencarcinom, papilläres Carcinom, papilläre Adenocarcinome, Zystadenocarcinom, Markcarcinom, bronchogenes Carcinom, Nierenzellencarcinom, Hepatom, Gallenwegcarcinom, Choriocarcinom, Seminom, embryonales Carcinom, Wilms'-Tumor, Halskrebs, Hodentumor, Carcinom der kleinen Lungenzellen, Blasencarcinom, Epithelcarcinom, Gliom, Astrozytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämagioblastom, akustisches Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neuroblastom, Retinoblastom oder Myälom.
Auf einem gleichen Weg werden mutierte oder Wildtyp- (nicht-mutierte) Nukleinsäuresegmente pathogener Organismen wie bakteriellen, viralen, fungalen, mykoplasmalen, rickettsialen, chlamydialen oder Protozoen-pathogenen gleichzeitig nachgewiesen.
BEISPIEL 11
Enzymtests
Die Erfindung ist auch zum Messen von Enzymen, Enzyminhibitoren, Enzymsubstraten, Enzymmetaboliten wie Laktad, ATP, Glucose und andere verwandte diagnostisch signifikante Analyte brauchbar. Beispielsweise können Perlenuntergruppen mit ausgewählten fluoreszierenden Substraten hergestellt werden, welche von der Perle enzymatisch abgespalten werden, was zu einem Verlust der Fluoreszenz führt. Enzyme, welche unter Anwendung vorliegender Erfindung nachgewiesen und gemessen werden können, umfassen, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, Proteasen, Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Lyasen, Ligasen, Synthetasen, Isomerasen, Glycosidasen und Nukleotidasen. Es kann jedes Enzym, das zu einer ausgewählten Bindungsspaltung führt, gemessen werden. Alternativ führt die Wirkung des Enzyms an dem an die Perle gebundenen Substrats zur Bildung oder Identifizierung eines Bindungspaars (Ligats) für einen fluoreszierenden, im Reaktionsgemisch vorliegenden Liganden. Die das modifizierte Substrat tragende Perle wird sodann fluoreszierend dank der Bindung des fluoreszierenden Liganden an das neu gebildete Ligat. Weil jede Art der das einzigartige Substrat tragenden Perle unterschieden werden kann, wird ein Gemisch von Perlenuntergruppen zur gleichzeitigen Messung verschiedener Enzymaktivitäten in dem gleichen Reaktionsgemisch verwendet.
Enzyminhibitoren sind Substanzen, welche eine enzymatische Reaktion hemmen. Viele derselben sind bei der klinischen Anwendung signifikant. Beispiele für Enzyminhibitoren umfassen Edrophoniumchlorid, N-Methylphysostigmin, Neostigminbromid, Physostigminsulfat, Tacrin, Tacrin-1-hydroxymaleat, Iodtubercidin, p-Bromtetramisol, 10-(a-Diethylaminopropionyl)phenothiazin, Calmidazolium, Hemicholinium-3, 3,5-Dinitrocatechin, Diacylglycerinkinase-Inhibitor I, Diacylglycerinkinaseinhibitor II, 3-Phenylpropargylamin, N-Monomethyl-L-arginin, Carbidopa, 3-Hydroxybenzylhydrazin, Hydralazin, Clorgylin, Deprenylhydroxylamin, Iproniazidphosphat, 6-MeO-tetrahydro-9H-pyridoindol, Nialamid, Pargylin, Chinacrin, Semicarbazid, Tranylcypromin, N,N-Diethylaminoethyl-2,2-diphenylvalerathydrochlorid, 3-Isobutyl-1-methylxanthen, Papaverin, Indomethacin, 2-Cyclooctyl-2-hydroxyethylamin, 2,3-Dichlor-a- methylbenzylamin (DCMB), 8,9-Dichlor-2,3,4,5-tetrahydro-1H-2-benzazepin, p-Aminoglutethimid, p-Aminoglutethimidtartrat, 3-Iodtyrosin, alpha-Methyltyrosin, L-, alpha-Methyltyrosin, L-acetazolamid, Dichlorphenamid, 6-Hydroxy-2-benzothiazolsulfonamid und Allopurinol.
Die vorhergehenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und Durchführung der meisten üblichen immundiagnostischen Enzym-, Arzneimittel- und/oder Nukleinsäuretests verwendet. Andere Anwendungen, wie z. B. ein Screeming hohen Durchsatzes von Chemiekombinationsbibliotheken zur Entdeckung neuer Arzneimittel, ein Screening von Umweltverschmutzungsmitteln, Arzneimitteltesten, auf Nahrungsmittelsicherheit bezogene Untersuchungen, Testen von Mehrfachanalyten für landwirtschaftliche Bedürfnisse usw. kann man sich vorstellen; sie werden nach bekannten Standardverfahren durchgeführt.
Während vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit speziellen Ausführungsformen derselben beschrieben wurde, liegt es auf der Hand, dass sie weiterer Modifizierungen fähig ist, und vorliegende Anmeldung soll irgendwelche Variationen, Verwendungen oder Veränderungen der Erfindung abdecken. In der Regel umfassen die Prinzipien der Erfindung solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, wie sie unter die bekannte oder übliche Praxis auf dem Fachgebiet fallen, dem vorliegende Erfindung zugehört, und wie sie auf die zuvor dargelegten wesentlichen Merkmale angewandt werden können und wie in den folgenden Patentansprüchen beschrieben.

Claims

Artikel, der einen Trägermikropartikel umfasst, an den eine vorbestimmte Menge Nanopartikel angebracht ist, welche mit mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind.
Artikel nach Anspruch 1, worin der Trägermikropartikel oder die Nanopartikel oder der Trägermikropartikel und die Nanopartikel ein Polymer umfassen.
Artikel nach Anspruch 1, worin der Trägermikropartikel einen Polymerpartikel mit einem Durchmesser zwischen etwa 0,1 μm und etwa 1.000 μm umfasst.
Artikel nach Anspruch 1, worin der Trägermikropartikel mindestens einen Fluoreszenzfarbstoff umfasst.
Artikel nach Anspruch 1, worin die Nanopartikel einen Polymerpartikel mit einem Durchmesser zwischen etwa 1 nm und etwa 100.000 nm umfassen.
Artikel nach Anspruch 2, worin das Polymer 0 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% eines Vernetzungsmittels umfasst.
Artikel nach Anspruch 2, worin das Polymer einen Magneten oder ein magnetisch reagierendes Metalloxid umfasst.
Artikel nach Anspruch 2, worin das Polymer weiterhin funktionelle Gruppen umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines fluoreszierenden Artikels, umfassend das Anbringen von mindestens einem Satz von Polymernanopartikeln an einen Trägerpolymermikropartikel, wobei jeder Satz Nanopartikel ein bestimmtes Fluoreszenzsignal besitzt.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das bestimmte Fluoreszenzsignal durch mindestens einen Fluoreszenzfarbstoff bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der Fluoreszenzfarbstoff in den Trägerpolymermikropartikel eingelagert ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Nanopartikel kovalent an den Trägermikropartikel angebracht sind.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Nanopartikel des Satzes durch Adsorption an den Trägermikropartikel angefügt sind.
Verfahren nach Anspruch 9, worin der fluoreszierende Artikel von einer polymeren Schale umgeben ist.
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit mindestens eines Analyten in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) des Mischens der Probe und bekannter Mengen Mikropartikel, auf denen mindestens ein fluoreszenzmarkierter Nanopartikel angeordnet ist, und mindestens eines analytischen Reaktanden, welcher mit einem jeweiligen Analyten bindet oder reagiert, zur Bildung einer Reaktionsmischung, und (b) des Analysierens der Mikropartikel, welche reagiert oder den Analyten gebunden haben, um die Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyten in der Probe festzustellen.
Verfahren nach Anspruch 15, worin der Mischungsschritt (a) weiterhin das Mischen einer vorbestimmten Menge eines Kompetitormoleküls in die Reaktionsmischung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, worin der Analyseschritt (b) die Analyse durch eine Durchflusszytometrie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, weiterhin umfassend einen Schritt (c) des Vergleichens des genannten Analyten gegen eine bekannte Menge eines Referenzmaterials.
Verfahren nach Anspruch 15, worin der Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen, einem Antikörper, einem Rezeptor, einem Hapten, einem Enzym, einem Protein, einem Peptid, einer Nukleinsäure, einem Arzneimittel, einem Hormon, einer Chemikalie, einem Polymer, einem Pathogen, einem Toxin und einer Kombination davon.
Verfahren nach Anspruch 15, worin der analytische Reaktand ein Bindungspaar des Analyten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Kompetitormolekül ein Molekül umfasst, welches in die Bindung des Analyten mit dem jeweiligen analytischen Reaktanden eingreift.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das Referenzmaterial im wesentlichen identisch mit dem Analyten in der Bindung mit dem jeweiligen analytischen Reaktanden ist.
Verfahren zur Detektion einer Vielzahl Analyten in einer Probe, wobei jeder der Analyten durch einen jeweiligen analytischen Reaktanden erkannt wird, umfassend: (a) das Kontaktieren der Probe mit einer Vielzahl Populationen fluoreszierender Artikel, wobei jede Population der Artikel ein bestimmtes Fluoreszenzsignal und einen bestimmten analytischen Reaktanden besitzt, worin der analytische Reaktand einen der Analyten in der Probe spezifisch bindet und wobei jeder fluoreszierende Artikel mindestens einen Nanopartikel umfasst, der mit einem jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, (b) das Hinzugeben der Probe zu einem Markierungsreagens, (c) die Analyse der Artikel zur Detektion der Markierung, welche die Bindung des Analyten an den analytischen Reaktanden anzeigt, und gleichzeitig (d) die Bestimmung der Populationen von Artikeln, welche an den jeweiligen Analyten gebunden haben, als eine Funktion des mit jeder Population verbundenen bestimmten Fluoreszenzsignals.
Verfahren nach Anspruch 23, worin das Verfahren eine Durchflusszytometrie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Populationen fluoreszierender Artikel weiterhin gemäß ihrer Größe oder Form bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 23, worin das Markierungsreagens ein Fluoreszenzmarkierungsreagens umfasst.
Kit, welches zur Verwendung bei der Detektion einer Vielzahl interessierender Analyten geeignet ist, umfassend: (a) eine Serie von Mikropartikeln mit angebundenen Nanopartikeln, welche ein bestimmtes Fluoreszenzsignal besitzen, und wobei jedes Mitglied der Serie einen analytischen Reaktanden besitzt, welcher zur spezifischen Bindung mit einem der interessierenden Analyten befähigt ist, (b) ein sekundäres Reagens, das ein Reagens umfasst, welches an denselben Analyten wie das analytische Reagens bindet, und (c) ein Fluoreszenzmarkierungsmittel, welches auf dem oder von dem sekundären Reagens bereit gestellt wird oder mit diesem verbunden ist, wobei bei Gebrauch des Kits der analytische Reaktand mit dem interessierenden Analyten durch spezifische Bindung verbunden wird, das sekundäre Reagens mit dem fluoreszenzierenden Artikel als Funktion der Bindung des Analyten an den spezifischen analytischen Reaktanden zur Verbindung befähigt ist, und ein Signal von dem Fluoreszenzmarkierungsmittel unabhängig von dem Fluoreszenzsignal der Mikropartikel durch das Signaldetektionsmittel detektierbar ist.
Kit gemäß Anspruch 27, weiterhin umfassend ein Kompetitormolekül, das zur Verhinderung der spezifischen Bindungswechselwirkung des analytischen Reaktanten mit dem Analyten befähigt ist.
Kit nach Anspruch 27, weiterhin umfassend ein Referenzmaterial, das in der Bindung mit dem jeweiligen analytischen Reaktanden im wesentlichen identisch mit dem Analyten ist.